Bên cạnh dịch chiết từ quả dành dành mẫu crocin chuẩn được cung cấp bởi hãng Sigma cũng được phân tích ở cùng điều kiện HPLC để làm mẫu tham chiếu. Kết quả cho thấy, ở cùng bước sóng hấp thụ 440 nm, sắc ký đồ của chất chuẩn crocin cũng xuất hiện 5 đỉnh ở các phút thứ 26,2; 26,7; 28,2; 28,9 và 30,2 phút. Trong số 5 đỉnh xuất hiện thì đỉnh lớn nhất xuất hiện ở phút thứ 26,2 tương tự như ở mẫu dịch chiết. Như vậy, có thể thấy rằng trong dịch chiết có chứa các thành phần crocin tương tự như trong mẫu crocin chuẩn. Tuy nhiên, để xác định chính xác loại crocin trong cả mẫu chất chuẩn và mẫu dịch chiết cần phải tiến hành các nghiên cứu khác chẳng hạn như LC-MS nhằm xác định khối lượng phân tử của hợp chất.
Hình 9: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn crocin ở các bước sóng 212 nm, 254 nm và 440 nm
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5 min -50 -25 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 mAU Ch4-440nm,4nm (1.00) Ch2-254nm,4nm (1.00) Ch1-212nm,4nm (1.00)
Bên cạnh việc quan sát ở bước sóng 440 nm, các thành phần hợp chất khác ngồi crocin được phát hiện ở bước sóng thấp hơn là 212 nm và 254 nm. Kết quả thể hiện trên sắc ký đồ hình 7 và 9 cũng cho thấy mẫu chuẩn chỉ chứa các hợp chất crocin trong khi mẫu dịch chiết cịn có lẫn nhiều chất khác, trong đó có các hợp chất hấp thụ bước sóng 254 nm với thời gian lưu là 15,5; 17,6 và 24,2 phút; hợp chất hấp thụ bước sóng 212 nm ở thời gian lưu là 2,6 phút. Điều này cũng hoàn toàn phù hợp về độ tinh sạch của crocin trong mẫu dịch chiết, vì đây là dịch chiết thơ chưa được tinh sạch qua cột. Tuy nhiên kết quả phân tích bằng HPLC trên cũng khẳng định bằng cách sử dụng nước làm dung môi tách chiết chúng tôi đã thu được nhiều loại crocin tương tự như chất chuẩn thương mại.
3.1.3. Xác định thành phần crocin bằng LC-MS
Thành phần crocin trong mẫu chuẩn (mẫu tham chiếu) và trong dịch chiết dành dành (mẫu thử nghiệm) được xác định bằng phương pháp đo phổ khối lượng (LC-MS) ở chu kỳ 25 phút. Kết quả được minh hoạ ở hình 10 cho thấy: thành phần crocin trong mẫu thí nghiệm hồn tồn giống mẫu tham chiếu với 5 đỉnh ở các thời gian lưu thời gian lưu 12,2; 12,7; 13,3; 16,2 và 17,1 phút. Phổ hấp thụ UV – Vis cho thấy các chất xuất hiện ở 5 thời gian lưu này hoàn toàn giống nhau ở cả mẫu thí nghiệm và mẫu tham chiếu (hình 11), đây cũng là phổ hấp phụ UV-Vis đặc trưng của các chất thuộc nhóm crocin đã được công bố bởi Hadizadeh và cộng sự [11]. Tuy nhiên, tương quan về độ lớn của các đỉnh có sự khác nhau ở mẫu tham chiếu và mẫu thí nghiệm chứng tỏ tỷ lệ về hàm lượng của mỗi loại crocin trong hai mẫu này khác nhau.
Hình 10: Sắc kí đồ LC-MS của mẫu crocin tham chiếu (A) và dịch chiết (B) tại bước sóng 440 nm