Hình 13 : Phổ khối ESI ở trạng thái ion âm của đỉnh P3 trong dịch chiết [M + Cl]-
Như vậy, trong mẫu dịch chiết và mẫu crocin tham chiếu đều có chứa 2 thành phần crocin là crocin-1 và crocin-2. Hàm lượng của hai loại crocin này trong dịch chiết và trong mẫu chuẩn được xác định bởi tương quan diện tích của các đỉnh tương ứng nhờ phương pháp HPLC phân tích trong thí nghiệm tiếp theo.
3.1.4. Xác định hàm lượng crocin trong dịch chiết dành dành
Mẫu chất chuẩn crocin được hòa tan trong methanol 80% ở nồng độ 0,5mg/mL và được phân tích ở 5 nồng độ khác nhau (các hình PL1-PL5 trong phụ lục) nhằm xây dựng đường tuyến tính giữa hàm lượng crocin và diện tích của các đỉnh tương ứng. Sau đó, dịch chiết dành dành ở nồng độ 2,0 mg/mL được phân tích ở cùng một điều kiện HPLC để hồi quy hàm lượng crocin tổng số (crocin-1 và crocin-2) dựa vào diện tích các đỉnh P1-P4.
Hình 15: Sắc ký đồ HPLC của dịch chiết dành dành ở hàm lượng 20 µg Bảng 6: Diện tích của các đỉnh P1-P4 trên sắc ký đồ HPLC của mẫu chuẩn tại bước Bảng 6: Diện tích của các đỉnh P1-P4 trên sắc ký đồ HPLC của mẫu chuẩn tại bước
sóng 440 nm Thể tích bơm mẫu chuẩn (µl) Hàm lượng mẫu chuẩn tương ứng với thể tích bơm mẫu (µg) Diện tích P1 (crocin-1) Diện tích P2 (crocin-1) Diện tích P3 (crocin-2) Diện tích P4 (crocin-1) Tổng diện tích của các đỉnh crocin 10 5,0 3140246 282438 440670 839200 4702554 15 7,5 3999925 391980 570000 1106134 6068038 20 10,0 5330577 594978 792526 1544730 8262811 25 12,5 6960347 757630 1117593 1874052 10709622 30 15,0 8440921 883590 1278491 2459022 13062024
Diện tích của các đỉnh P1 – P4 trên sắc ký đồ HPLC (minh hoạ trên hình 14) và hàm lượng mẫu crocin chuẩn qua mỗi chu kỳ phân tích được trình bày trong bảng 6. Số liệu trên cho thấy mối tương quan thuận giữa hàm lượng mẫu và diện tích của các đỉnh của crocin chuẩn. Từ đó phương trình hồi quy tuyến tính được xây dựng là y = 854421x + 16800 với x là hàm lượng crocin tổng số trong mẫu chuẩn, y là tổng diện tích các đỉnh crocin và được trình bày trong hình 16. Hệ số tương quan R2 = 0,99 cho khoảng hàm lượng 5-15 μg cho thấy tỉ lệ diện tích đỉnh sắc ký của crocin và hàm lượng của chất chuẩn phụ thuộc tuyến tính một cách chặt chẽ với. Do đó, đường chuẩn này được sử dụng để xác định hàm lượng crocin tổng số trong dịch chiết dành dành ở khoảng tuyến tính đã khảo sát này.
Hình 16: Đường chuẩn của mẫu chuẩn crocin
Để phân tích hàm lượng crocin trong dịch chiết dành dành, 20μg bột dịch chiết được hoà tan trong 80% methanol và bơm vào hệ thống HPLC với các điều kiện phân tích tương tự như phân tích mẫu crocin chuẩn. Kết quả về diện tích các đỉnh sắc ký và hàm lượng crocin trong mẫu dịch chiết được trình ở bảng 7 dưới đây.
y = 854421x + 16800 R² = 0,99 0.0 2000000.0 4000000.0 6000000.0 8000000.0 10000000.0 12000000.0 14000000.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 Tổng diện tích các đỉnh cr ocin
Bảng 7: Diện tích các đỉnh trong sắc ký đồ của dịch chiết (bước sóng 440 nm) và hàm lượng crocin trong mẫu dịch chiết
Đỉnh sắc ký Diện tích Diện tích đỉnh sắc ký của mỗi loại crocin Tỉ lệ tương đối giữa các thành phần crocin (%) Tổng diện tích đỉnh sắc ký Hàm lượng crocin (µg) tính theo đường chuẩn Tỷ lệ crocin trong dịch chiết (%) P1 (crocin-1) 5305859 6219934 85,64 7262539 8,48 42,4 P2 (crocin-1) 77508 P4 (crocin-1) 836567 P3 (crocin-2) 1042603 1042603 14,36
Từ số liệu ở bảng 7, có thể thấy rằng tổng diện tích đỉnh sắc ký của crocin là 7262539. Dựa trên phương trình trình hồi quy tuyến tính đã xây dựng là y = 854421x + 16800 với x là hàm lượng crocin trong mẫu chuẩn, y là tổng diện tích các đỉnh crocin thì hàm lượng tương đối của crocin trong dịch chiết được xác định là 8,48 μg, chiếm 42,4% khối lượng của bột dịch chiết. Trong nghiên cứu của các tác giả Jiang Zhiguo và cộng sự năm 2010, bằng phương pháp sắc ký ngược dịng cơ quay chậm (slow rotary countercurrent chromatography- SRCCC) với hệ dung môi là methyl tert-butyl ether, n-butanol, acetonitrile và nước (2:2.5:1:5, tính theo tỉ lệ thể tích) thu được 2,47 g crocin từ 5g dịch chiết thô, tương đương với 49,4% [39]. Hàm lượng crocin tổng số thu được theo nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn không đáng kể so với nghiên cứu của Jiang Zhihou, đồng thời phương pháp chiết sử dụng dung môi nước đảm bảo tính an tồn cao trong định hướng ứng dụng dịch chiết để làm phẩm màu thực phẩm.
Ngoài ra, tỉ lệ giữa diện tích các đỉnh sắc ký của crocin-1 (đỉnh P1, P2 và P4) và crocin-2 (đỉnh P3) cho thấy crocin-1 chiếm tỉ lệ 85,6% (tương đương với hàm
lượng 7,26 μg) và crocin-2 chiếm tỉ lệ 14,36% (tương đương với hàm lượng 1,22 μg) trong tổng số crocin. Như vậy, so với khối lượng tồn bộ dịch chiết thì crocin-1 chiếm 36,3% và crocin-2 chiếm 6,1%. Theo nghiên cứu của Shao-cheng Chen và cộng sự năm 2017, trong dịch chiết methanol 70% từ quả dành dành chứa genipin, gentiobioside, gardenoside, crocin-1 và crocin-2 với hàm lượng lần lượt là 1,03%, 5,90%, 1,26% và 0,17% [5]. Như vậy, có thể thấy rằng, dung môi nước cho thấy khả năng tách chiết được crocin-1 và crocin-2 với hàm lượng cao hơn so với dung môi methanol.
3.2. Khảo sát tác dụng chống oxi hoá của dịch chiết dành dành
Để khảo sát tác dụng chống oxi hóa của dịch chiết dành dành, khả năng chống oxi hóa của dịch chiết dành dành được xác định bằng khả năng khử gốc tự do DDPH (1,1-diphenyl-1- picrylhydrazyl) và được so sánh, đánh giá với axit ascorbic, một hợp chất chống oxi hóa đã biết, kết quả được thể hiện ở hình 17.
Kết quả minh hoạ ở hình 17 cho thấy rằng hoạt tính khử gốc tự do DDPH của dịch chiết dành dành phụ thuộc vào nồng độ, cụ thể hơn khi nồng độ càng cao thì hoạt tính của dịch chiết càng lớn. Mức độ ức chế lớn nhất là 91% ở nồng độ dịch chiết dành dành là 1,0 g/L. Giá trị IC50 của dịch chiết dành dành là 0,33 g/L trong khi giá trị này của axit ascorbic (một hợp chất chống oxi hóa đã biết) là 0,02 g/L. Như vậy, dịch chiết dành dành có thể hiện khả năng chống oxi hóa, mặc dù hoạt tính chống oxi hóa của nó yếu hơn axit ascorbic. Điều này cho thấy, dịch chiết từ dành dành rất tốt để ứng dụng làm màu thực phẩm thay thế màu thực phẩm tổng hợp bởi vì chúng khơng những tạo nên màu sắc đẹp cho thực phẩm mà cịn mang lại lợi ích cho sức khỏe của con người.
Hình 17: Hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết dành dành so với axit ascorbic
3.3. Khảo sát tính an tồn của chế phẩm màu
Sắc tố vàng được chiết xuất từ hạt dành dành từ lâu đã được sử dụng như một loại phẩm màu trong ngành công nghiệp chế biến thực phẩm. Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có nhiều kết quả thử nghiệm về độ an toàn của dịch chiết dành dành, do vậy việc kiểm tra và đánh giá độc tính của dành dành là điều thực sự cần thiết để cho người tiêu dùng biết được mức độ an toàn của sản phẩm bột màu từ dành dành.
3.3.1. Đánh giá độc tính của dịch chiết dành dành trên chuột
Chuột nhắt trắng Swiss được cho uống dịch chiết dành dành ở các mức liều là 2062 mg/kg, 4125 mg/kg, 8250 mg/kg, 16500 mg/kg và 33000 mg/kg trọng lượng cơ thể (dịch chiết dành dành được pha trong nước). Sau 72 giờ nghiên cứu, tất cả các con chuột đều sống sót và khỏe mạnh. Kể cả ở liều sử dụng cao lên đến 33,0 g/kg trọng lượng cơ thể thì các con chuột vẫn khơng có bất kỳ biểu hiện bất thường nào, đó đó cũng chưa thể xác định được giá trị LD50 của dịch chiết dành dành. Ở một số nghiên cứu trước đó của Sato và cộng sự năm 2007 về độc tính của dịch chiết dành dành trên chuột cho thấy rằng chuột 13 tuần tuổi sau 3 tháng sử dụng bột dịch chiết dành dành chứa 2,783% geniposide (hàm lượng tương đương với 60 mg/kg/ngày) vẫn hoàn toàn khỏe mạnh [25]. Như vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tơi cùng hồn tồn phù hợp về mức độ an toàn của dịch chiết dành dành trên đối tượng nghiên cứu chuột nhắt trắng.
0. 25. 50. 75. 100. 0.005 0.01 0.05 0.1 0.2 0.4 0.8 1 % Ứ c ch ế Nồng độ (g/L) Dịch chiết dành dành Axit ascorbic
3.3.2. Đánh giá ảnh hưởng lên phát triển của phôi cá ngựa vằn
Số lượng phôi chết ở các thời điểm 24h, 48h và 72h sau khi phơi nhiễm với các nồng độ dịch chiết được thống kê và biểu diễn dưới dạng đường cong đáp ứng liều (Hình 18).
Hình 18 : Biểu đồ thể hiện tỷ lệ phơi chết khi phơi nhiễm với dịch chiết dành dành Nhìn chung, ảnh hưởng độc tính của dịch chiết dành dành lên phôi cá tăng dần theo thời gian và nồng độ. Sau 24 giờ phơi nhiễm, dịch chiết gần như không gây ảnh hưởng đến sức sống của phôi cá, không xuất hiện phôi chết ở cả 7 nồng độ thí nghiệm. Tại thời điểm 48 giờ, bắt đầu quan sát được những ảnh hưởng độc tính của dịch chiết ở các nồng độ cao 4, 8, 12 g/L, tỷ lệ phôi chết tăng dần theo nồng độ: 0% ở nồng độ thấp hơn 4 g/L, xấp xỉ 5% ở nồng độ 4 g/L và 55% ở nồng độ 12 g/L. Tại thời điểm kết thúc thử nghiệm (72 giờ), tỷ lệ tử vong tiếp tục tăng đều ở tất cả các nồng độ, ở nồng độ 12 g/L đạt tới 100%, nồng độ 8 g/L đạt 80% và nồng độ 2 g/L đã tăng tới 10%, ấu thể phơi nhiễm với nồng độ 0,1, 0,5 và 1 g/L không bị ảnh hưởng đáng kể lên sức sống. Bằng phần mềm Graphpad Prism, chúng tơi tính tốn được LC50 tại thời điểm 72h của dịch chiết dành dành là 4,9 g/L. Hiện nay, đã có một số nghiên cứu in vivo và in vitro về độc tính của dịch chiết dành dành [4, 36],
trong đó liều dùng trong các thử nghiệm dược tính của dịch chiết thường dao động từ 50 mg/kg – 200 mg/kg/ngày thấp hơn so với nồng độ không quan sát thấy ảnh hưởng trên phôi cá ngựa vằn (0,5 g/L) và thấp hơn rất nhiều liều bắt đầu gây chết
(2,0 g/L). Như vậy, có khoảng cách về liều mang hiệu quả dược tính và liều gây độc cấp tính, cho thấy dịch chiết tương đối an toàn. Tuy nhiên, vẫn cần thêm những nghiên cứu đánh giá về ảnh hưởng của dịch chiết khi sử dụng liên tục kéo dài ở liều cao, trong một nghiên cứu của Yutaka và cộng sự thực hiện khảo sát trên 52 bệnh nhân cùng sử dụng các sản phẩm chứa dịch chiết từ quả dành dành với liều lượng dao động từ 1-3 g trong thời gian dài (trung bình 11 năm), 10 người trong số đó mang chứng xơ cứng tĩnh mạch mạc treo tràng trên. Kết quả cho thấy nhóm mang bệnh sử dụng nhiều sản phẩm từ dịch chiết dành dành hơn hẳn so với nhóm khơng mắc bệnh, với lượng dịch chiết tích lũy ở nhóm mang bệnh 6539,0 g so với 997,5 g ở nhóm so sánh. Nhóm nghiên cứu đã đưa ra khuyến cáo rằng việc sử dụng liên tục dịch chiết dành dành ở liều cao trong thời gian dài có khả năng gây xơ cứng tĩnh mạch mạc treo tràng trên [23].
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phôi cá ngựa vằn là đối tượng rất mẫn cảm với các độc tố từ môi trường sống. Những dấu hiệu bất thường về hình thái được quan sát sau mỗi 24 giờ cho tới thời điểm 72 giờ và được minh hoạ như ở hình 19 dưới đây. Sau khi phơi nhiễm với dịch chiết dành dành, trong 48 giờ đầu không quan sát được những thay đổi đáng kể về hình thái phơi cá ngựa vằn. Đến thời điểm 72 giờ, một số ấu thể cá ngựa vằn xuất hiện những bất thường về hình thái bên ngồi như: nỗn hồng đen, mất sắc tố, nỗn hồng chia cắt bất thường và tụ máu ở màng nỗn hồng. Những dị dạng này có phân bố theo nồng độ khác nhau: hiện tượng nỗn hồng chia cắt bất thường chỉ quan sát được ở các nồng độ khá thấp như 1-2 g/L trong khi đó ảnh hưởng lên sắc tố của cá lại chỉ quan sát thấy ở các nồng độ cao hơn như 4-12 g/L. Tụ máu và nỗn hồng đen là 2 dị dạng ít phổ biến hơn và khơng phụ thuộc nồng độ, có thể giả thiết rằng chúng là biểu hiện ảnh hưởng của hóa chất lên những cá thể nhạy cảm hơn trong quần thể. Như vậy, có thể thấy rằng sau thời gian 72 giờ khảo sát thử nghiệm, các nồng độ 0,1; 0,5 và 1 g/L là nồng độ an tồn đối với phơi cá ngựa vằn.
Hình 19: Hình ảnh dị dạng của phơi cá ngựa vằn ở thời điểm 72h khi phơi nhiễm với dịch chiết dành dành nồng độ trên 1g/L
A.Đối chứng; B,C: Nỗn hồng đen; D,E: Mất sắc tố; F: nỗn hồng phân cắt bất thường; G: Tụ máu; Mũi tên màu đen chỉ ra các điểm bất thường.
3.4. Khảo sát một số tính chất vật lý của chế phẩm màu vàng 3.4.1. Độ hòa tan 3.4.1. Độ hòa tan
Độ hòa tan của bột màu là một tiêu chí quan trọng để đánh giá khả năng ứng dụng làm màu thực phẩm. Ngồi ra, độ hịa tan cũng ảnh hưởng đến khả năng thực hiện các thí nghiệm tiếp theo nhằm đánh giá các tính chất hóa học và sinh học của bột dành dành.
0,1 g/L 0,4 g/L 0,8 g/L
Hình 20: Độ hịa tan của bột chế phẩm màu dành dành trong nước
Dựa vào kết quả ở hình trên, có thể thấy rằng bột dành dành có thể tan hồn tồn tốt trong nước để tạo thành dạng dung dịch đồng nhất ở cả 3 nồng độ khác nhau là 0,1 g/L, 0,4 g/L và 0,8 g/L. Khả năng tan tốt trong nước của bột màu dành dành được đánh giá là tương đương với phẩm màu tổng hợp Tartrazine đang được lưu thông trên thị trường hiện nay.
3.4.2. Khả năng chịu pH
Bên cạnh độ hịa tan thì độ bền màu đối với pH cũng là yếu tố quan trọng để đánh giá khả năng ứng dụng làm phẩm màu của bột dành dành. Trong quá trình chế biến thực phẩm không thể tránh khỏi việc phối trộn nhiều nguyên liệu khác nhau, do đó có thể ảnh hưởng độ pH của thực phẩm. Do đó, bột dành dành nếu có độ ổn định cao trong các điều kiện pH khác nhau thì sẽ là một ưu điểm lớn trong việc ứng dụng nó để làm phẩm màu thực phẩm.
Ảnh hưởng của pH đối với độ bền màu của sắc tố vàng trong dịch chiết dành dành được thể hiện trong Hình 21. Dịch chiết dành dành thu được ngay sau quá trình tách chiết có độ pH bằng 5,6 và có độ bền màu là 100%. Dịch chiết dành dành sau đó được xử lý bằng dung dịch NaOH và dung dịch HCl nhằm điều chỉnh độ pH của dịch chiết từ 1,0 đến 12,0. Kết quả minh họa ở hình 21 cho thấy rằng sắc tố vàng có độ ổn định cao trong các điều kiện pH từ 1,0 đến 12,0 với độ bền màu trên 90%. Cụ thể hơn, sắc tố vàng trong dịch chiết dành dành có độ bền màu cao nhất ở dải pH từ 9,0 đến 12,0.
Hình 21: Ảnh hưởng của độ pH đến độ bền màu của dịch chiết dành dành
3.4.3. Khả năng chịu nhiệt
Độ bền màu của dịch chiết dành dành được khảo sát ở dải nhiệt độ từ 40 đến 100ºC, kết quả về khả năng chịu nhiệt của dịch chiết dành dành như được thể hiện ở Hình 22.
Kết quả cho thấy độ bền màu của sắc tố vàng bị giảm nhẹ tương ứng với sự tăng lên của nhiệt độ. Độ bền màu của sắc tố vàng bị giảm nhiều nhất ở nhiệt độ 100ºC với mức giảm 11,5% so với ở nhiệt độ 40ºC độ bền màu chỉ giảm 1,7%. Tuy nhiên, sự giảm độ bền màu như vậy là khơng đáng kể. Do đó, có thể kết luận rằng