Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế OECD và tổ chức tiêu chuẩn quốc tế ISO đã đưa ra các tài liệu hướng dẫn thử nghiệm độc tính hóa chất sử dụng phơi cá ngựa vằn (OECD 236 và ISO 15088:2007). Dựa vào đó, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã xây dựng quy trình thí nghiệm áp dụng trong điều kiện sẵn có của phịng thí nghiệm và ứng dụng trong đánh giá độc tính của ba dung mơi là ethanol, dimethyl sulfoxide và acetone [1]. Kết quả thu được có độ tương đồng cao với kết quả được đưa ra bởi OECD. Phương pháp sử dụng trong luận văn này giống với phương pháp trong nghiên cứu trên chứng tỏ kết quả đưa ra có thể được chấp nhận và có độ tin cậy cao.
Để xác định dải nồng độ cho thí nghiệm đánh giá độc tính của các chất, chúng tơi đã tiến hành thí nghiệm với nhiều nồng độ để tìm ra một khoảng nồng độ hẹp nhất mà vẫn đảm bảo giá trị dưới khơng gây bất kì ảnh hưởng nào đến phơi, ấu thể thí nghiệm và giá trị trên gây chết tồn bộ phơi sau khi thí nghiệm kết thúc (96 giờ sau thụ tinh). Dung dịch gốc của các chất thử nghiệm được chuẩn bị bằng cách hòa tan từ dạng bột (với Sodium benzoate, Propyl gallate, Amaranth, Tartrazine, Monosodium glutamate) và từ dạng dung dịch Formaldehyde 36% trong mơi trường E3 sau đó cũng được pha lỗng thành các dải nồng độ bằng mơi trường E3. Ở một vài thử nghiệm đầu, hóa chất sẽ được đánh giá ở những dải nồng độ rộng rồi thu hẹp dần dựa trên kết quả thu được của thí nghiệm trước đó. Sự tác động của các hóa chất đến sinh vật thường tuân theo phương trình Sigmoidal với giá trị nồng độ biểu diễn theo thang logarit. Do đó, chúng tơi chia khoảng nồng độ đã xác định thành một dải gồm sáu đến tám nồng độ dựa theo một cấp số nhân với giá trị công bội tùy thuộc vào từng chất thí nghiệm. Cuối cùng, chúng tôi thu được các dải nồng độ đánh giá cho từng chất như Bảng 3.1.
Bảng Error! No text of specified style in document..5. Các dải nồng độ thí nghiệm của các chất Tên hóa chất Kí hiệu Độ tan trong 100 ml nước Đơn vị
pha loãng Dải nồng độ thí nghiệm
Sodium
benzoate E211 62,87 g mg 25 45 80 145 260 350 500 650
Propyl gallate E310 350 mg mg 15 20 26 35 45 60 75
Amaranth E123 5 g g 0,1 0,2 0,5 1 2 4 8
Tartrazine E102 14 g g 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Monosodium
glutamate E621 10 g g 2 5 10 15 25 40 60
3.1. SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI VÀ SỨC SỐNG CỦA PHÔI CÁ NGỰA VẰN KHI PHƠI NHIỄM VỚI CÁC CHẤT PHỤ GIA VẰN KHI PHƠI NHIỄM VỚI CÁC CHẤT PHỤ GIA
3.1.1. Hình thái phơi cá ngựa vằn đối chứng
Hình thái của phơi, ấu thể cá ngựa vằn ở lô đối chứng cũng được ghi nhận và được sử dụng như một tiêu chuẩn để xác định sự dị dạng khi phơi nhiễm với hóa chất. Ở 24 giờ sau thụ tinh, bên trong phôi đã xuất hiện những chuyển động tự phát. Mắt, đá tai đã hình thành, đồng thời đi đã phát triển dài và tách khỏi khối noãn hồng. Phần mở rộng của nỗn hồng cũng đã thấy rõ ràng (Hình Error! No text of
specified style in document..7).
Ở 48 giờ sau thụ tinh, chúng ta có thể dễ dàng quan sát thấy rõ nhịp đập đều đặn của tim cùng với dòng vận chuyển máu dọc theo trục cơ thể và trên nỗn hồng. Sắc tố cũng hình thành đầy đủ ở mắt và dọc theo cơ thể đến tận cuối của đuôi. Các chất trong nỗn hồng được sử dụng làm chất dinh dưỡng nuôi cơ thể nên kích thước của nỗn hồng giảm đi rõ rệt so với thời điểm 24 giờ sau thụ tinh. Đến thời điểm 96 giờ sau thụ tinh, ấu thể đã thốt ra khỏi lớp màng phơi và có thể bơi tự do. Lúc này, trục cơ thể đã trở nên thẳng, vây bơi hình thành, khối hỗn hồng thon gọn, sắc tố trên thân tập trung nhiều quanh khu vực hình thành bóng bơi nên vùng này sậm màu hơn các vùng khác. Ngồi ra, miệng ấu thể cũng đã nhơ về phía trước (Hình Error! No text of specified style in document..7).
Hình Error! No text of specified style in document..7. Hình thái phơi và ấu thể cá ngựa vằn đối chứng
A: 24 giờ sau thụ tinh; B: 48 giờ sau thụ tinh; C: 96 giờ sau thụ tinh
3.1.2. Hình thái phơi khi phơi nhiễm với nhóm chất tạo màu
3.1.2.1. Phơi nhiễm với chất tạo màu vàng Tartrazine (E102)
Khi phơi nhiễm với Tartrazine, chỉ sau hai giờ phơi nhiễm với các nồng độ từ 8 g/l trở lên, sự phát triển phôi cá ngựa vằn đi theo hai hướng rõ ràng. Hướng thứ nhất, phơi có hình thái và sự phát triển khơng có nhiều khác biệt so với đối chứng. Những phôi này vẫn sẽ tiếp tục phát triển bình thường qua thời điểm 24 giờ sau thụ tinh. Chiều hướng thứ hai là phơi cá sẽ hình thành nhiều bất thường như đĩa phơi xù xì, các phơi bào có thể tách nhau ra, không còn liên kết thành một khối trên cực động vật, hoặc cả đĩa phơi sau đó khối nỗng hồng sẽ bị tan ra dẫn đến việc chúng không thể sống đến thời điểm 24 giờ sau thụ tinh (Hình Error! No text of specified style in document..8).
Hình Error! No text of specified style in document..8. Phôi cá ngựa vằn khi phơi nhiễm với Tartrazine nồng độ 8 g/l
Sau 2 giờ phơi nhiễm, một số phơi xù xì mất đi sự liên kết giữa các phôi bào (A) và sẽ tan ra khi quan sát ở thời điểm 24 giờ sau thụ tinh (B)
Tại thời điểm 24 giờ sau thụ tinh, sức sống của phơi thí nghiệm chỉ bị ảnh hưởng khi phơi nhiễm với nồng độ 8g/l trở lên. Tỷ lệ phôi bị chết do tác động của
hai nồng độ 8g/l và 16 g/l lần lượt là khoảng 10% và 90%. Tiếp tục phơi nhiễm đến 72 giờ sau thụ tinh, số lượng phôi chết gần như không tăng thêm. Các đường đồ thị tương quan giữa nồng độ E102 và sức sống phôi ở ba thời điểm đầu quan sát trong
Hình Error! No text of specified style in document..9 (đường màu đỏ) gần như
trùng khít lên nhau cũng thể hiện điều này. Hiện tượng này có thể giải thích do đích tác động gây chết của Tartrazine tập trung chủ yếu ở thời điểm phát triển phôi sớm trước thời điểm 24 giờ sau thụ tinh, vì thế ở các giai đoạn tiếp sau, khi mà các cơ quan đã tương đối hồn thiện thì chất này khơng gây chết thêm phơi.
Các dị dạng trên phôi cá ngựa vằn quan sát được ở thời điểm 48 giờ sau thụ tinh là phù túi nỗn hồng, tụ máu và chỉ xuất hiện khi phơi nhiễm với Tartrazine ở nồng độ từ 8 g/l trở lên. Vị trí tụ máu thường quan sát được sự tụ máu là phía trên phần phình nỗn hồng, trên đầu hay cả ở đi sát với phần kéo dài của nỗn hồng (Hình Error! No text of specified style in document..10 A, B, C).
Hình Error! No text of specified style in document..9. Tỷ lệ phơi cịn sống và tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Tartrazine ở thời điểm 24, 48 và 72 giờ sau
thụ tinh
Đường màu đỏ thể hiện tỷ lệ phôi sống; đường màu đen thể hiện tỷ lệ phôi dị dạng trên tổng số phơi cịn sống; thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn giữa kết quả các lần thí nghiệm
Hình Error! No text of specified style in document..10. Phôi cá ngựa vằn khi phơi nhiễm với Tartrazine
A, B, C: nồng độ 8 g/l ở 48 giờ sau thụ tinh; D, E, F, G nồng độ 1g/l ở 96 giờ sau thụ tinh e: phù nề; h: tụ máu; n: hoại tử
Ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh, chúng tôi nhận thấy vài điểm đặc biệt khi phơi nhiễm với Tartrazine. Thứ nhất là mức độ dị dạng của phôi cá khi phơi nhiễm với E102 ở nồng độ thấp hơn lại nặng nề hơn nhiều so với phơi nhiễm nồng độ cao trong dải nồng độ thí nghiệm. Cụ thể ở đây là nồng độ 1-2 g/l và nồng độ 8 g/l trở lên. Hình Error! No text of specified style in document..10D-G cho thấy rằng nồng độ 1 g/l gây ra hiện tượng phần phình của khối nỗn hồng của ấu thể khơng cịn giữ được hình dạng elip mà có thể bị tách ra thành nhiều phần nhỏ, hoặc phù nề nghiêm trọng kèm theo việc xuất hiện một khối hoại tử bên trong. Do bị phù, màng nỗn hồng lúc này rất yếu và rất dễ vỡ làm các thành phần bên trong, kể cả khối hoại tử tràn ra ngồi. Nỗn hồng phình to, dị dạng kéo theo hiện tượng trục cơ thể của ấu thể cũng bị cong, gập tại vị trí đó. Hiện tượng phù nề khơng chỉ bắt gặp ở khối nỗn hồng mà cả ở phần thân cạnh nỗn hồng, trên đầu, dưới mắt và cả vây ngực. Ngoài ra, ấu thể cịn bị dị tật phần cuối đi, hoại tử trên cơ thể cũng như bị tụ máu. Trong khi đó, phơi được phơi nhiễm với nồng độ 8g/l chỉ phù màng bao
h h, e h h h h e e e n
tim, hoại tử và phù nhẹ màng bao nỗn hồng, tụ máu, một vài trường hợp bị cong đuôi. Hiện tượng nêu trên có thể là một bằng chứng của hiệu ứng liều thấp (low dose effect) – mức độ ảnh hưởng ở nồng độ thấp nghiêm trọng hơn nồng độ cao. Một vài lý do được đưa ra để giải thích cho hiện tượng này là chất thử nghiệm có cấu trúc tương tự một loại hormone nào đó nên cũng tương tác với các thụ thể hoặc ảnh hưởng đến quá trình tạo hormone, đến các con đường di chuyển hormone [88].
Thứ hai, hiện tượng tụ máu là kiểu dị dạng phổ biến nhất khi phơi nhiễm với Tartrazine (Hình Error! No text of specified style in document..22C). Từ thời điểm 48 giờ sau thụ tinh, chúng tôi thấy việc tăng đáng kể tế bào máu đỏ xuất hiện quanh khối nỗn hồng. Có thể vì thế nên dẫn tới sự tắc nghẽn mạch máu trên vài phôi ở thời điểm này và hầu hết ấu thể ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh. Ấu thể có thể bị một hoặc một vài điểm, ở nhiều vị trí và hình thức khác nhau. Điểm tụ máu quan sát được có thể ngay dưới miệng, ở nỗn hồng gần sát vùng tim hoặc bên trong nỗn hồng gần phần cơ, trên đầu hoặc dưới đi. Hình thức có thể là một khối nhỏ màu đỏ hoặc tăng mạnh lượng tế bào máu đỏ tại một vị trí nào đó cũng có thể khiến cả phần phù nề ở nỗn hồng có màu hồng hơn bình thường (Hình Error! No text of specified style in document..10 E). Hiện tượng tụ máu bắt gặp nhiều có thể do Tartrazine đã tác động đến các gen liên quan đến q trình đơng máu hoặc làm tăng sự hình thành, phát triển mạch máu. Tuy nhiên vẫn cần thực hiện các nghiên cứu chuyên sâu để khẳng định giả thuyết này.
Thứ ba, bên cạnh những phôi bị dị dạng, ở hầu hết các nồng độ trong dải nồng độ thí nghiệm đều tồn tại một vài phôi không quan sát thấy bất kì sự ảnh hưởng nào đến hình thái phơi sau 96 giờ phơi nhiễm. Hiện tượng này được thể hiện trong Hình Error! No text of specified style in document..11 với tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Tartrazine không đạt tới 100% hay tỷ lệ các loại dị dạng kể cả dị dạng hay gặp nhất là tụ máu cũng không đạt được 100% phơi cịn sống (Hình
Error! No text of specified style in document..22C). Vậy cơ chế nào bảo vệ những
Thứ tư, tỷ lệ phôi dị dạng cũng như tỷ lệ phôi chết khi phơi nhiễm với Tartrazine dường như khơng tn theo quy luật thơng thường (Hình Error! No text of specified style in document..11, Phụ lục 1). Hai tỷ lệ này không tăng liên tục theo chiều tăng nồng độ mà chững lại ở khoảng nồng độ 4 đến 8 g/l. Do nồng độ 1 g/l và 2 g/l ảnh hưởng nghiêm trọng đến hình thái phơi ngay sau khi phơi nở ở 72 giờ sau thụ tinh nên đến thời điểm 96 giờ sau thụ tinh, hai nồng độ này làm chết nhiều phôi hơn nồng độ 4 và 8 g/l. Nồng độ 12 và 16 g/l đã gây tác động lớn ngay từ thời điểm hai giờ sau phơi nhiễm nên tỷ lệ chết tính tới thời điểm 96 giờ sau thụ tinh vẫn cao hơn các nồng độ còn lại. Tỷ lệ ấu thể dị dạng ở nồng độ 2 g/l là cao nhất (khoảng 93%) trong khi ở nồng độ 12 g/l chỉ khoảng 72%.
Hình Error! No text of specified style in document..11. Tỷ lệ phơi cịn sống và tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Tartrazine ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh
Đường màu đỏ thể hiện tỷ lệ phôi sống; đường màu đen thể hiện tỷ lệ phôi dị dạng trên tổng số phơi cịn sống; thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn giữa kết quả các lần thí nghiệm
3.1.2.2. Phơi nhiễm với chất tạo màu đỏ Amaranth (E123)
Sự tác động của Amaranth đến sự phát triển phôi cá ngựa vằn khá giống với Tartrazine nhưng sự ảnh hưởng xuất hiện khi phơi nhiễm với nồng độ thấp hơn. Sau 2 giờ phơi nhiễm, phôi cá phơi nhiễm với Amaranth nồng độ từ 4 trở lên cũng quan sát thấy hiện tượng làm tan đĩa phơi và nỗn hồng cùng với hệ quả gây chết sau 24
giờ sau thụ tinh (Phụ lục 2). Sở dĩ Amaranth và Tartrazine gây ra tác động nhanh chóng như vậy là vì chúng khơng bị hoặc rất ít bị ngăn cản bởi màng phơi. Tính thấm qua màng phơi bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố; một trong số đó là đặc tính ưa lipit (Lipophilicity) của chất được thử nghiệm. Những chất này có thể dễ dàng đi qua lớp màng phôi để ảnh hưởng trực tiếp đến phôi [28] và hai phụ gia E102 và E123 đều có đặc tính này.
Sức sống của phơi thí nghiệm ở thời điểm 24 giờ sau thụ tinh chỉ bị ảnh hưởng khi phơi nhiễm với nồng độ 4 và 8 g/l. Tỷ lệ phôi bị chết do tác động của hai nồng độ này lần lượt là 55% và 100%. Ở 48 giờ sau thụ tinh, Amaranth không gây chết thêm phôi so với 24 giờ sau thụ tinh (Hình Error! No text of specified style in
document..12, Phụ lục 3). Cùng với đó, E123 rất ít gây ảnh hưởng đến hình thái
phơi thí nghiệm ở hai thời điểm này.
Hình Error! No text of specified style in document..12. Tỷ lệ phơi cịn sống và tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Amaranth
Đường màu đỏ thể hiện tỷ lệ phôi sống; đường màu đen thể hiện tỷ lệ phôi dị dạng trên tổng số phơi cịn sống; thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn giữa kết quả các lần thí nghiệm
Sau khi phôi cá ngựa vằn nở, Amaranth lại tác động rất lớn đến cả hình thái cũng như sức sống của ấu thể. Tại thời điểm 72 giờ sau thụ tinh, nồng độ 0,5 g/l và
1 g/l đã làm chết lần lượt khoảng 17% và 35% ấu thể còn nồng độ 4g/l gây chết đến 82%. Ở 96 giờ sau thụ tinh, mức độ ảnh hưởng của ba nồng độ này tương ứng là 31,7%; 60,1% và 93% (Hình Error! No text of specified style in document..12). Hình thái phơi cũng bị biến đổi rất nhiều ở thời điểm này. Hiện tượng phơi nhiễm ở nồng độ thấp hơn lại ảnh hưởng đến hình thái ấu thể nhiều hơn khi phơi nhiễm với nồng độ cao hơn trong dải thí nghiệm cũng được ghi nhận ở các nồng độ 0,5 g/l; 1 g/l và 4 g/l. Kiểu dị dạng quan sát được cũng tương tự như ảnh hưởng của Tartrazine: nỗn hồng biến dạng, trục cơ thể bị cong, phù đầu và tụ máu (Hình Error! No text of specified style in document..13). Sự biến dạng nỗn hồng do Amaranth gây ra có hơi khác với Tartrazine: khối noãn thường bị hoại tử nhiều và có thể bị chia thành nhiều phần, sự phù túi nỗn hồng cũng ít gặp hơn và hiếm thấy có khối hoại tử bên trong và Amaranth không gây ra hiện tượng tụ máu nhiều như Tartrazine. Tỷ lệ phôi chết và dị dạng ghi nhận được do tác động của E123 vẫn tăng khi nồng độ