CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM
2.3.2. Phơi nhiễm với hóa chất
Thí nghiệm của chúng tơi được xây dựng dựa theo hướng dẫn thử nghiệm độc tính hóa chất trên phơi cá ngựa vằn của Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế (OECD 236 công bố ngày 26/7/2013) và hướng dẫn đánh giá chất lượng nước thải theo ISO 15088:2007. Theo đó, việc phơi nhiễm phơi nên được thực hiện sớm nhất có thể và muộn nhất là không quá 3 giờ sau thụ tinh (giai đoạn 128 tế bào) [62].
Sau khi được rửa sạch, phôi thụ tinh giai đoạn 4 đến 32 tế bào được chuyển vào đĩa 6 giếng đã có sẵn hóa chất thí nghiệm (trên 25 phơi/một nồng độ/giếng). Những phôi khỏe mạnh, phát triển bình thường sẽ được chọn dưới kính hiển vi soi nổi với độ phóng đại tối thiểu là 20x. Giai đoạn phân cắt từ 4 tế bào trở đi, phôi chất lượng tốt có thể dễ dàng phân biệt với phôi không thụ tinh hoặc bất thường dựa vào sự trong suốt, đĩa phôi được phân cắt đồng đều, đối xứng, màng phôi và khối nỗn hồng ngun vẹn. Những phôi tốt được chuyển ngẫu nhiên mỗi phôi vào một giếng của đĩa ni cấy 24 giếng đã có sẵn 1ml hóa chất ở mỗi giếng theo sơ đồ bố trí nồng độ thí nghiệm như Hình Error! No text of specified style in document..5.
Hóa chất thí nghiệm được pha theo một dải từ sáu đến tám nồng độ sử dụng môi trường E3. Dải này thu được sau nhiều thí nghiệm kiểm tra giới hạn tác động (limit test) với mục đích tìm ra khoảng nhỏ nhất có chứa nồng độ gây chết tồn bộ phôi và nồng độ không quan sát thấy ảnh hưởng sau khi kết thúc thí nghiệm. Mỗi nồng độ được tra vào 20 giếng của đĩa nuôi cấy 24 giếng, 4 giếng còn lại là đối chứng nội là dung môi hịa tan các chất thử (trong thí nghiệm này là mơi trường E3) (Hình Error! No text of specified style in document..5).
Hình Error! No text of specified style in document..5. Phân bố nồng độ trên đĩa 24 giếng
T: các giếng có cùng nồng độ hóa chất thí nghiệm, C: đối chứng
Cứ sau 24 giờ, mỗi giếng trong các đĩa thí nghiệm lại được thay khoảng 700µl/giếng bằng dung dịch mới có nồng độ hóa chất tương ứng. Quy trình được
tiến hành tương tự với đĩa đối chứng (môi trường E3) để so sánh đối chiếu. Tồn bộ thí nghiệm được giữ ở nhiệt độ 260
C ± 10C. Mỗi thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần.
2.3.3. Đánh giá sự ảnh hưởng của các chất phụ gia tới sự phát triển phơi dựa trên hình thái và sức sống
Tại các thời điểm 24, 48, 72, 96 giờ sau thụ tinh, chúng tơi sẽ quan sát phơi dưới kính hiển vi soi nổi và đánh giá theo các tiêu chí như Bảng Error! No text of specified style in document..4. Việc đánh giá hình thái phôi sẽ dựa vào các đặc điểm phôi cá ngựa vằn theo mơ tả của Kimmel và cộng sự (Hình Error! No text of specified style in document..6) [40]. Kết quả của thí nghiệm chỉ được chấp nhận khi tỷ lệ phơi cịn sống của đối chứng ở thời điểm kết thúc thí nghiệm đạt trên 90%.
Bảng Error! No text of specified style in document..4. Một số tiêu chí đánh giá sự phát triển phơi cá ngựa vằn
Tiêu chí Miêu tả
Thời gian (giờ sau thụ tinh)
24 48 72 96 Tiêu chí gây chết
Đơng tụ Phôi màu trắng đục và không nhận rõ cấu trúc
x x x x
Tim không đập Không quan sát thấy tim đập x x Tiêu chí dị dạng
Cong vẹo trục cơ thể
Trục cơ thể bị uốn cong ở một vài điểm
Dị tật đuôi Đuôi ngắn hoặc cong so với bình thường x x
Sắc tố Giảm sắc tố mắt và thân x x
Phù màng bao tim Màng bao ngoài tim bị phù x x
Phù túi nỗn hồng
Màng bao nỗn hồng xuất hiện túi chứa dịch
Nỗn hồng xù xì Bề mặt khối nỗn hồng xù xì x
Phù đầu Hoại tử
Phần đầu xuất hiện túi chứa dịch Đầu hoặc thân xuất hiện khối tế bào chết
x x x
x x
Nghẽn mạch máu Chưa nở
Xuất hiện các điểm máu tụ trên cơ thể Phôi cịn sống nhưng chưa thốt khỏi lớp
màng phôi
x x x
x
Tiêu chí đánh giá trên được xây dựng dựa theo tiêu chí được mơ tả bởi Nagel và cộng sự năm 2002 [54].
Hình Error! No text of specified style in document..6. Hình thái phơi cá ngựa vằn ở một số giai đoạn theo Kimmel [40]
2.3.4. Đánh giá sự ảnh hưởng của các chất đến nhịp tim phôi/ấu thể cá ngựa vằn vằn
Phôi cá ngựa vằn giai đoạn 4 đến 32 tế bào sẽ được phơi nhiễm với các nồng độ hóa chất và đối chứng E3 trên đĩa 6 giếng; 10 phôi mỗi nồng độ/giếng. Nhịp tim của ít nhất 5 trên 10 phôi này (chọn ngẫu nhiên) sẽ được ghi lại bằng máy quay phim dưới dạng các video có độ dài một phút và thí nghiệm sẽ được tiến hành hai lần. Số nhịp tim của phơi/ấu thể cá khi phơi nhiễm với hóa chất sẽ được đếm và so sánh thống kê với phôi/ấu thể đối chứng của chính lơ thí nghiệm đó theo tỷ lệ phần trăm sử dụng phần mềm GraphPad Prism 6.07.
2.3.5. Phân tích thống kê
Các phép tính tốn cơ bản được tính bằng cơng cụ Microsoft Excel 2013. Phần mềm GraphPad Prism 6.07 thực hiện tất cả các phân tích thống kê bao gồm các phép hồi quy và các so sánh giữa các lơ thí nghiệm với lơ đối chứng.
Kết quả của thí nghiệm về tỷ lệ phơi cịn sống cũng như tỷ lệ phôi dị dạng sẽ xử lý hồi quy với dạng bốn tham số của phương trình Sigmoidal:
Trong đó: Top và Bottom là giá trị cao nhất và thấp nhất của Y Y là tỷ lệ phôi chết/sống hoặc dị dạng
X là log của nồng độ thí nghiệm
XC50 có thể là giá trị LC50 hoặc EC50 HillSlope thể hiện độ dốc của đường cong
Từ đó, phần mềm cho phép đưa ra biểu thức và đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ thí nghiệm và sự ảnh hưởng của hóa chất đối với sự phát triển phơi cá ngựa vằn đồng thời tính các chỉ số độc tính LC50 – nồng độ gây chết 50% phơi thí nghiệm và EC50 – nồng độ gây ảnh hưởng đến 50% phôi hoặc ấu thể. Dựa trên kết quả thu được, chỉ số gây quái thai TI (Teratogenic index) sẽ được xác định bằng tỷ
số LC50/EC50. Một chất được cho là gây quái thai khi TI >1 và được cho là gây chết phôi khi TI < 1 [69].
Phương pháp Mann Whitney test được sử dụng để so sánh sự khác biệt giữa lơ đối chứng và các nồng độ thí nghiệm về tỷ lệ phôi nở ở 72 giờ cũng như số nhịp tim/phút. Sự khác biệt được cho là có ý nghĩa khi p < 0,05.
Chỉ số NOEC (No Observed Effect Concentration) cho biết nồng độ hóa chất thí nghiệm cao nhất khơng có ảnh hưởng đáng kể đến phơi thí nghiệm và chỉ số LOEC (Lowest observed effect concentration) cho biết nồng độ thấp nhất tác động đáng kể đến phơi thí nghiệm theo các tiêu chí đã nêu ở trên được xác định bằng Dunnett’s test với độ tin cậy 95%.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế OECD và tổ chức tiêu chuẩn quốc tế ISO đã đưa ra các tài liệu hướng dẫn thử nghiệm độc tính hóa chất sử dụng phơi cá ngựa vằn (OECD 236 và ISO 15088:2007). Dựa vào đó, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã xây dựng quy trình thí nghiệm áp dụng trong điều kiện sẵn có của phịng thí nghiệm và ứng dụng trong đánh giá độc tính của ba dung mơi là ethanol, dimethyl sulfoxide và acetone [1]. Kết quả thu được có độ tương đồng cao với kết quả được đưa ra bởi OECD. Phương pháp sử dụng trong luận văn này giống với phương pháp trong nghiên cứu trên chứng tỏ kết quả đưa ra có thể được chấp nhận và có độ tin cậy cao.
Để xác định dải nồng độ cho thí nghiệm đánh giá độc tính của các chất, chúng tơi đã tiến hành thí nghiệm với nhiều nồng độ để tìm ra một khoảng nồng độ hẹp nhất mà vẫn đảm bảo giá trị dưới khơng gây bất kì ảnh hưởng nào đến phơi, ấu thể thí nghiệm và giá trị trên gây chết tồn bộ phơi sau khi thí nghiệm kết thúc (96 giờ sau thụ tinh). Dung dịch gốc của các chất thử nghiệm được chuẩn bị bằng cách hòa tan từ dạng bột (với Sodium benzoate, Propyl gallate, Amaranth, Tartrazine, Monosodium glutamate) và từ dạng dung dịch Formaldehyde 36% trong mơi trường E3 sau đó cũng được pha lỗng thành các dải nồng độ bằng mơi trường E3. Ở một vài thử nghiệm đầu, hóa chất sẽ được đánh giá ở những dải nồng độ rộng rồi thu hẹp dần dựa trên kết quả thu được của thí nghiệm trước đó. Sự tác động của các hóa chất đến sinh vật thường tuân theo phương trình Sigmoidal với giá trị nồng độ biểu diễn theo thang logarit. Do đó, chúng tơi chia khoảng nồng độ đã xác định thành một dải gồm sáu đến tám nồng độ dựa theo một cấp số nhân với giá trị công bội tùy thuộc vào từng chất thí nghiệm. Cuối cùng, chúng tôi thu được các dải nồng độ đánh giá cho từng chất như Bảng 3.1.
Bảng Error! No text of specified style in document..5. Các dải nồng độ thí nghiệm của các chất Tên hóa chất Kí hiệu Độ tan trong 100 ml nước Đơn vị
pha lỗng Dải nồng độ thí nghiệm
Sodium
benzoate E211 62,87 g mg 25 45 80 145 260 350 500 650
Propyl gallate E310 350 mg mg 15 20 26 35 45 60 75
Amaranth E123 5 g g 0,1 0,2 0,5 1 2 4 8
Tartrazine E102 14 g g 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Monosodium
glutamate E621 10 g g 2 5 10 15 25 40 60
3.1. SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI VÀ SỨC SỐNG CỦA PHƠI CÁ NGỰA VẰN KHI PHƠI NHIỄM VỚI CÁC CHẤT PHỤ GIA VẰN KHI PHƠI NHIỄM VỚI CÁC CHẤT PHỤ GIA
3.1.1. Hình thái phơi cá ngựa vằn đối chứng
Hình thái của phơi, ấu thể cá ngựa vằn ở lô đối chứng cũng được ghi nhận và được sử dụng như một tiêu chuẩn để xác định sự dị dạng khi phơi nhiễm với hóa chất. Ở 24 giờ sau thụ tinh, bên trong phôi đã xuất hiện những chuyển động tự phát. Mắt, đá tai đã hình thành, đồng thời đi đã phát triển dài và tách khỏi khối noãn hồng. Phần mở rộng của nỗn hồng cũng đã thấy rõ ràng (Hình Error! No text of
specified style in document..7).
Ở 48 giờ sau thụ tinh, chúng ta có thể dễ dàng quan sát thấy rõ nhịp đập đều đặn của tim cùng với dòng vận chuyển máu dọc theo trục cơ thể và trên nỗn hồng. Sắc tố cũng hình thành đầy đủ ở mắt và dọc theo cơ thể đến tận cuối của đuôi. Các chất trong nỗn hồng được sử dụng làm chất dinh dưỡng ni cơ thể nên kích thước của nỗn hồng giảm đi rõ rệt so với thời điểm 24 giờ sau thụ tinh. Đến thời điểm 96 giờ sau thụ tinh, ấu thể đã thoát ra khỏi lớp màng phơi và có thể bơi tự do. Lúc này, trục cơ thể đã trở nên thẳng, vây bơi hình thành, khối hỗn hồng thon gọn, sắc tố trên thân tập trung nhiều quanh khu vực hình thành bóng bơi nên vùng này sậm màu hơn các vùng khác. Ngồi ra, miệng ấu thể cũng đã nhơ về phía trước (Hình Error! No text of specified style in document..7).
Hình Error! No text of specified style in document..7. Hình thái phơi và ấu thể cá ngựa vằn đối chứng
A: 24 giờ sau thụ tinh; B: 48 giờ sau thụ tinh; C: 96 giờ sau thụ tinh
3.1.2. Hình thái phơi khi phơi nhiễm với nhóm chất tạo màu
3.1.2.1. Phơi nhiễm với chất tạo màu vàng Tartrazine (E102)
Khi phơi nhiễm với Tartrazine, chỉ sau hai giờ phơi nhiễm với các nồng độ từ 8 g/l trở lên, sự phát triển phôi cá ngựa vằn đi theo hai hướng rõ ràng. Hướng thứ nhất, phơi có hình thái và sự phát triển khơng có nhiều khác biệt so với đối chứng. Những phơi này vẫn sẽ tiếp tục phát triển bình thường qua thời điểm 24 giờ sau thụ tinh. Chiều hướng thứ hai là phơi cá sẽ hình thành nhiều bất thường như đĩa phơi xù xì, các phơi bào có thể tách nhau ra, khơng cịn liên kết thành một khối trên cực động vật, hoặc cả đĩa phơi sau đó khối nỗng hoàng sẽ bị tan ra dẫn đến việc chúng không thể sống đến thời điểm 24 giờ sau thụ tinh (Hình Error! No text of specified style in document..8).
Hình Error! No text of specified style in document..8. Phơi cá ngựa vằn khi phơi nhiễm với Tartrazine nồng độ 8 g/l
Sau 2 giờ phơi nhiễm, một số phơi xù xì mất đi sự liên kết giữa các phơi bào (A) và sẽ tan ra khi quan sát ở thời điểm 24 giờ sau thụ tinh (B)
Tại thời điểm 24 giờ sau thụ tinh, sức sống của phơi thí nghiệm chỉ bị ảnh hưởng khi phơi nhiễm với nồng độ 8g/l trở lên. Tỷ lệ phôi bị chết do tác động của
hai nồng độ 8g/l và 16 g/l lần lượt là khoảng 10% và 90%. Tiếp tục phơi nhiễm đến 72 giờ sau thụ tinh, số lượng phôi chết gần như không tăng thêm. Các đường đồ thị tương quan giữa nồng độ E102 và sức sống phơi ở ba thời điểm đầu quan sát trong
Hình Error! No text of specified style in document..9 (đường màu đỏ) gần như
trùng khít lên nhau cũng thể hiện điều này. Hiện tượng này có thể giải thích do đích tác động gây chết của Tartrazine tập trung chủ yếu ở thời điểm phát triển phôi sớm trước thời điểm 24 giờ sau thụ tinh, vì thế ở các giai đoạn tiếp sau, khi mà các cơ quan đã tương đối hồn thiện thì chất này khơng gây chết thêm phôi.
Các dị dạng trên phôi cá ngựa vằn quan sát được ở thời điểm 48 giờ sau thụ tinh là phù túi nỗn hồng, tụ máu và chỉ xuất hiện khi phơi nhiễm với Tartrazine ở nồng độ từ 8 g/l trở lên. Vị trí tụ máu thường quan sát được sự tụ máu là phía trên phần phình nỗn hồng, trên đầu hay cả ở đi sát với phần kéo dài của nỗn hồng (Hình Error! No text of specified style in document..10 A, B, C).
Hình Error! No text of specified style in document..9. Tỷ lệ phơi cịn sống và tỷ lệ phơi dị dạng khi phơi nhiễm với Tartrazine ở thời điểm 24, 48 và 72 giờ sau
thụ tinh
Đường màu đỏ thể hiện tỷ lệ phôi sống; đường màu đen thể hiện tỷ lệ phôi dị dạng trên tổng số phơi cịn sống; thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn giữa kết quả các lần thí nghiệm
Hình Error! No text of specified style in document..10. Phôi cá ngựa vằn khi phơi nhiễm với Tartrazine
A, B, C: nồng độ 8 g/l ở 48 giờ sau thụ tinh; D, E, F, G nồng độ 1g/l ở 96 giờ sau thụ tinh e: phù nề; h: tụ máu; n: hoại tử
Ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh, chúng tôi nhận thấy vài điểm đặc biệt khi phơi nhiễm với Tartrazine. Thứ nhất là mức độ dị dạng của phôi cá khi phơi nhiễm với E102 ở nồng độ thấp hơn lại nặng nề hơn nhiều so với phơi nhiễm nồng độ cao trong dải nồng độ thí nghiệm. Cụ thể ở đây là nồng độ 1-2 g/l và nồng độ 8 g/l trở lên. Hình Error! No text of specified style in document..10D-G cho thấy rằng nồng độ 1 g/l gây ra hiện tượng phần phình của khối nỗn hồng của ấu thể khơng cịn giữ được hình dạng elip mà có thể bị tách ra thành nhiều phần nhỏ, hoặc phù nề nghiêm trọng kèm theo việc xuất hiện một khối hoại tử bên trong. Do bị phù, màng nỗn hồng lúc này rất yếu và rất dễ vỡ làm các thành phần bên trong, kể cả khối hoại tử tràn ra ngồi. Nỗn hồng phình to, dị dạng kéo theo hiện tượng trục cơ thể của ấu thể cũng bị cong, gập tại vị trí đó. Hiện tượng phù nề không chỉ bắt gặp ở khối nỗn hồng mà cả ở phần thân cạnh nỗn hồng, trên đầu, dưới mắt và cả vây ngực. Ngoài ra, ấu thể cịn bị dị tật phần cuối đi, hoại tử trên cơ thể cũng như bị tụ máu. Trong khi đó, phơi được phơi nhiễm với nồng độ 8g/l chỉ phù màng bao
h h, e h h h h e e e n
tim, hoại tử và phù nhẹ màng bao nỗn hồng, tụ máu, một vài trường hợp bị cong