3.1. Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng
3.1.1. Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID
Tách tế bào MDCK từ chai ra phiến với mật độ 4x104 tế bào/ml. Sau 2 ngày nuôi cấy tế bào MDCK trên các phiến 96 giếng đều kín 1 lớp.
Hình 3.1. Tế bào MDCK kín một lớp sau 2 ngày ni cấy
Hiện có 2 phƣơng pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm thƣờng đƣợc áp dụng là phƣơng pháp tạo đám hoại tử (PFU) và phƣơng pháp CCID50. Nhiều nhà sản xuất trên thế giới nhƣ ở Mỹ, Hàn Quốc, Indonesia… thƣờng sử dụng phƣơng pháp CCID50 trong sản xuất vắcxin cúm do chỉ một số chủng vi rút cúm (nhƣ cúm A/H5N1) mới có thể tạo đƣợc đám hoạt tử nhìn rõ cịn hầu hết các chủng vi rút cúm khác (nhƣ chủng A/New York/19/2009 (A/H1N1), A/Hong Kong/8/1968 (A/H3N2), A/New York/55/2004 (A/H3N2)) rất khó đọc đƣợc đám hoại tử [15]. Trong khi đó, phƣơng pháp CCID50 thực hiện đƣợc trên tất cả các loại chủng cúm vì vậy chúng tơi dùng phƣơng pháp CCID50 để thực hiện chuẩn độ hiệu giá vi rút trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của mình. Phƣơng pháp CCID50 thơng dụng hơn nhƣng cũng đòi hỏi ngƣời thực hiện phải có kinh nghiệm vì khi quan sát hủy hoại tế bào trên kính hiển vi điện tử dễ nhầm với hình ảnh tế bào già.
Chúng tơi đã tiến hành thử nghiệm 3 lần nhằm đảm bảo độ chính xác để tối ƣu hóa các yếu tố ảnh hƣởng đến quy trình chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm: nhiệt độ,
môi trƣờng và thời gian nuôi cấy vi rút. Các phiến trƣớc khi tiến hành thử nghiệm có mật độ tế bào tƣơng đƣơng nhau. Sau ngày thứ nhất, các phiến nuôi ở 32oC và 37oC tại cả 3 loại mơi trƣờng khơng có sự khác biệt nhiều, chƣa xuất hiện hủy hoại ở nồng độ cao nhất là 10-1
. Ngày thứ hai, phiến nuôi ở 37oC cả 3 loại môi trƣờng đã xuất hiện hủy hoại trong khi phiến nuôi ở 32oC hầu nhƣ chƣa quan sát đƣợc.
Ngày thứ 2
Nuôi vi rút tại 32oC Ni vi rút tại 37o
C Chứng
tế bào
10-1
Hình 3.2. Tế bào MDCK chứng và đã đƣợc gây nhiễm vi rút cúm nồng độ 10-1
sau 2 ngày, nuôi ở nhiệt độ 32oC và 37oC bằng môi trƣơng MEM.
Ngày thứ ba, phiến nuôi ở 37oC quan sát hủy hoại rất rõ cịn phiến ni ở 32oC có xuất hiện hủy hoại nhƣng khơng nhiều bằng phiến nuôi ở 37o
C. Phiến tế bào ở môi trƣờng MEM và DMEM có hình ảnh hủy hoại tƣơng tự nhau và nhiều hơn phiến môi trƣờng LH3E.
Ngày thứ 3 Nuôi vi rút tại 32o C Nuôi vi rút tại 37o C Chứng tế bào 10-8 10-6 10-1
Hình 3.3. Tế bào MDCK chứng và đã đƣợc gây nhiễm vi rút cúm nồng độ 10-1, 10-6, 10-8 sau 3 ngày, nuôi ở nhiệt độ 32oC và 37o
C bằng môi trƣờng MEM.
Ngày thứ tƣ, phiến nuôi ở 37oC không đọc đƣợc kết quả do giếng chứng tế bào già và chết nhiều. Trong khi đó, phiến ni ở 32oC cho kết quả đọc tốt. Các phiến tế bào ở mơi trƣờng MEM và DMEM có hình ảnh hủy hoại tƣơng tự nhau và nhiều hơn phiến môi trƣờng LH3E.
thứ 4 Chứng tế bào 10-8 10-6 10-1
Hình 3.4. Tế bào MDCK chứng và đã đƣợc gây nhiễm vi rút cúm nồng độ 10-1, 10-6, 10-8 sau 4 ngày, nuôi ở nhiệt độ 32oC và 37o
C bằng môi trƣơng MEM
Ngày thứ năm, không đọc đƣợc kết quả của phiến nuôi ở 37oC nhƣng phiến nuôi ở 32o
C vẫn quan sát đƣợc hủy hoại hình ảnh tƣơng tự ngày thứ tƣ, giếng chứng tế bào không quá dày.
Bảng 3.1. Kết quả chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm với các điều kiện thử nghiệm khác nhau (lần 1)
32oC 37oC
3 ngày 4 ngày 5 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày LH3E 102,0 104,2 104,2 104,2 - - MEM 104,0 107,8 107,8 105,4 - - DMEM 104,4 107,6 107,6 105,4 - -
Bảng 3.2. Kết quả chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm với các điều kiện thử nghịêm khác nhau (lần 2)
32oC 37oC
3 ngày 4 ngày 5 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày LH3E 103,0 106,2 106,4 104,5 - - MEM 104,3 108,0 108,1 106,5 - - DMEM 104,2 108,0 108,0 106,4 - -
Bảng 3.3. Kết quả chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm với các điều kiện thử nghiệm khác nhau (lần 3)
32oC 37oC
3 ngày 4 ngày 5 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày LH3E 102,5 106,5 106,4 104,0 - - MEM 103,8 108,2 108,1 106,8 - - DMEM 104,0 108,2 108,1 106,8 - - Nhiệt độ Thời gian Môi trƣờng Nhiệt độ Thời gian Môi trƣờng Nhiệt độ Thời gian Mơi trƣờng
Hình 3.5. So sánh chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm 3 loại môi trƣờng MEM, DMEM, LH3E tại 32oC sau 3 ngày, 4 ngày và 5 ngày ( Giá trị trung bình của 3
lần thử nghiệm)
Kết quả ở 3 lần thử nghiệm cho thấy vi rút cúm đƣợc nuôi ở môi trƣờng DMEM và MEM có kết quả tƣơng tự nhau, cịn ở môi trƣờng LH3E tế bào hủy hoại kém hơn nhiều, do đó chúng tơi chọn ni ở mơi trƣờng MEM vì kết quả tốt và giá thành thấp hơn hơn môi trƣờng nuôi cấy DMEM. Vi rút nuôi ở 32oC có thể xác định đƣợc hiệu giá tốt hơn ở 370
C vào ngày thứ 3 và sau 4 ngày nuôi cấy ở 37oC gần nhƣ không đọc đƣợc kết quả. Sau 4 và 5 ngày nuôi cấy vi rút, hiệu giá vi rút đọc đƣợc là tƣơng tự nhau và cao hơn so với ngày thứ 3, do đó chúng tơi chọn thời gian nuôi vi rút vào ngày thứ 4 vì thời gian này cho kết quả tốt, tiết kiệm đƣợc thời gian và đọc kết quả thuận lợi hơn sau 5 ngày do tế bào chứng chƣa bị già.
Qua các kết quả thu đƣợc sau 3 lần tiến hành lặp lại thử nghiệm chúng tơi đã tìm đƣợc các điều kiện tối ƣu cho quy trình chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm là:
- Nhiệt độ nuôi cấy vi rút: 32oC
- Môi trƣờng nuôi cấy vi rút: môi trƣờng MEM - Thời gian nuôi cấy vi rút: 4 ngày
Trong nghiên cứu này, kết quả của chúng tôi cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu đã đƣợc tiến hành tại Trung tâm nghiên cứu vắcxin cúm, trƣờng đại học
Utah- Hoa Kỳ. Các tác giả tại đây cũng đã tìm ra các điều kiện để tiến hành chuẩn độ vi rút cúm là môi trƣờng MEM và thời gian nuôi cấy vi rút là 4 ngày nhƣng có điểm khác biệt là phƣơng pháp đƣợc tiến hành ở nhiệt độ 37oC, có thể là do họ dùng dịng tế bào MDCK khác.