Phƣơng pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 (liều vi rút gây hủy

2.1. VẬT LIỆU

2.2.1. Phƣơng pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 (liều vi rút gây hủy

hoại 50% tế bào)

2.2.1.1. Pha môi trƣờng * Môi trƣờng MEM

Công thức pha môi trƣờng MEM

Bảng 2.1. Cơng thức pha mơi trƣờng MEM STT Hóa chất Đơn vị Cơng thức pha 1 lít STT Hóa chất Đơn vị Cơng thức pha 1 lít

1 MEM g 13,4

2 NaHCO3 g 0,5

3 L- Glutamin g 0,292

4 Kanamycin g 0,1

5 Fungizone ml 1

6 Nƣớc cất pha tiêm vừa đủ ml 1000

* Môi trƣờng DMEM

Công thức pha môi trƣờng DMEM

Bảng 2.2. Công thức pha môi trƣờng DMEM STT Hóa chất Đơn vị Cơng thức pha 1 lít STT Hóa chất Đơn vị Cơng thức pha 1 lít

1 DMEM g 13,4

2 NaHCO3 g 0,5

3 L- Glutamin g 0,292

5 Fungizone ml 1

6 Nƣớc cất pha tiêm vừa đủ ml 1000

* Môi trƣờng LH3E

Công thức pha môi trƣờng LH3E

Bảng 2.3. Công thức pha mơi trƣờng LH3E

STT Tên hóa chất Đơn vị Cơng thức pha 1 lít

1 NaH2PO4 g 0,061 2 MgSO4 g 0,0485 3 CaCl2.2H2O g 0,133 4 NaCl g 3,4,0 5 KCl g 0,2, 6 Glucose g 3,5 7 Lactalbumin hydrolyzate g 2,5 8 MEM g 4,8 9 Đỏ phenol ml 0,5 10 NaHCO3 g 1,4

11 Nƣớc cất pha tiêm vừa đủ lít 1,0

2.2.1.2. Chuẩn bị tế bào MDCK

- Soi chai tế bào MDCK trên kính hiển vi, tế bào phải kín một lớp. Hút bỏ hết nƣớc nổi trong chai tế bào.

- Cho Hanks vào chai tế bào, láng đều cho sạch hết tế bào chết rồi hút bỏ hết nƣớc nổi.

- Cho Trypsin-EDTA vào chai tế bào, để 36  1o

C/ 3-5 phút cho tế bào bong ra.

- Cho môi trƣờng MEM 10% FBS/chai tế bào đã tách, trộn đều bằng pipet. - Bổ sung môi trƣờng MEM 10% FBS vào chai tế bào, trộn đều.

- Chia hỗn dịch tế bào vào phiến 96 giếng, 100l/ giếng. - Nuôi cấy phiến tế bào ở 37 o

C, CO2 5% trong 2 ngày. - Soi tế bào trên kính hiển vi hàng ngày.

2.2.1.3. Gây nhiễm vi rút trên tế bào MDCK

- Pha loãng mẫu thử theo cấp 10 từ 10-1 đến 10-8 - Rửa các giếng tế bào bằng 100l Hank’

s

- Gây nhiễm 100l các nồng độ pha loãng mẫu thử vào các giếng khác nhau trên phiến, mỗi nồng độ pha loãng 4 giếng. Làm song song 4 giếng chứng âm bằng cách thay thế mẫu thử bằng dung dịch Hank’s.

- Ủ phiến tế bào trong tủ ấm ở các nhiệt độ 32C và 37 o

C- 5% CO2 trong 1 giờ.

- Sau 1 giờ hút hết hỗn dịch vi rút trong các giếng.

- Cho 100l các mơi trƣờng duy trì có bổ sung Trypsin đã xử lý TPCK vào mỗi giếng. Sử dụng 3 loại mơi trƣờng duy trì MEM, DMEM và LH3E ở từng phiến tế bào.

- Nuôi cấy phiến tế bào ở các nhiệt độ 32C và 37C, CO2 5% trong 3, 4 và 5 ngày.

- Lặp lại các thử nghiệm trên 3 lần.

2.2.1.4. Đọc kết quả

- Soi kính hiển vi xác định các giếng có sự hủy hoại tế bào (CPE) - Tiêu chuẩn chấp thuận:

+ Hàng tế bào chứng mọc đẹp, khơng có huỷ hoại

+ Mức độ huỷ hoại tế bào giảm dần theo mức độ pha lỗng mẫu thử - Cơng thức:

A – 50%

A - B

Trong đó: N: Khoảng cách 50% CCID50 A: Tỉ lệ % (+) trên 50% B: Tỉ lệ % (+) dƣới 50%

CCID50 = (Log A + N ) x 10

- So sánh hình ảnh trên kính hiển vi điện tử và kết quả CCID50 các mẫu thử nuôi cấy ở các điều kiện:

+ Nhiệt độ: 32oC và 37oC

+ Môi trƣờng duy trì: MEM, DMEM và LH3E + Thời gian nuôi cấy: 3, 4 và 5 ngày.

2.2.2. Phƣơng pháp chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngƣng kết hồng cầu [47]

Nguyên lý

Hiệu giá kháng nguyên HA của mẫu thử đƣợc xác định qua khả năng gây ngƣng kết hồng cầu.

Chuẩn bị dung dịch hồng cầu gà 0,5%

- Dùng bơm tiêm lấy 3 ml máu gà vào ống ly tâm đã có sẵn 5ml dung dịch chống đông Alsever.

- Rửa hồng cầu gà 3 lần trong PBS 0,01M, ly tâm 2000 vòng/ phút, trong 5 phút, loại bỏ nƣớc nổi.

- Cặn hồng cầu gà pha thành 0,5% trong PBS 0,01M.

Các bước tiến hành: sử dụng phiến 96 giếng đáy chữ U

- Pha loãng mẫu thử nghiệm bậc hai trong các giếng trên phiến nhựa bằng dung dịch đệm PBS 0,01M từ nồng độ 2-1 đến 2-12 (có thể pha lỗng với nồng độ thấp hơn tùy thuộc vào hiệu giá HA của mẫu thử), thể tích mỗi giếng là 50l.

- Bổ sung vào tất cả các giếng, mỗi giếng 50l dung dịch hồng cầu gà 0,5%. - Song song với các mẫu thử nghiệm tiến hành làm các mẫu chứng dƣơng và chứng âm bằng cách thay thế thành phần mẫu thử nghiệm bằng chứng dƣơng và thay thế thành phần mẫu thử nghiệm bằng dung dịch đệm PBS (chứng âm).

- Lắc nhẹ phiến. Để yên ở nhiệt độ phòng 30 phút.

Kết quả

- Trƣớc tiên đọc các giếng chứng. Chứng âm phải khơng có ngƣng kết hồng cầu, chứng dƣơng đúng nhƣ hiệu giá đã biết.

- Độ pha lỗng cao nhất của kháng ngun cịn gây ngƣng kết hồng cầu với một đơn vị, giá trị nghịch đảo của độ pha lỗng đó là hiệu giá kháng nguyên (HAU).

2.2.3. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng kháng nguyên HA bằng SRID [47].

Nguyên tắc

Hàm lƣợng kháng nguyên HA đƣợc xác định qua phản ứng ngƣng kết miễn dịch khuyếch tán đơn (SRID).

Các bước tiến hành

 Chuẩn bị 2 phiến thạch miễn dịch giống hệt nhau: đƣợc tiến hành trên bàn thăng bằng. Một cặp phiến SRID (13ml agarose 1%) có thể làm đƣợc 3 mẫu thử nghiệm và 1 mẫu kháng nguyên chuẩn.

- Làm tan chảy dung dịch agarose 1%, giữ trong bể ủ nhiệt 56oC trong ít nhất 30 phút.

- Chuẩn bị 2 phiến thủy tinh, lau sạch bề mặt bằng agarose 1%. Đặt khuôn thủy tinh khoét lỗ đƣờng kính 90 nm lên trên và hàn kín khe hở bằng agarose 1%, giữ trong 5 phút.

- Pha loãng kháng huyết thanh chuẩn 10 lần bằng dung dịch PBS 0,01M. - Trộn đều, tránh tạo bọt 150µl kháng huyết thanh chuẩn đã pha loãng ở trên vào 13ml agarose 1%. Đổ vào khuôn đang đƣợc đặt trên mặt bàn thăng bằng,

- Sau khi agarose đông (khoảng 30 phút), đục các giếng đƣờng kính 4mm trên bề mặt agarose.

 Chuẩn bị kháng nguyên

- Đánh dấu các ống eppendorf 1,5 ml để pha loãng kháng nguyên chuẩn và mẫu thử nghiệm.

- Pha loãng kháng nguyên chuẩn và các mẫu thử bằng dung dịch PBS 0,01M sao cho nồng độ kháng nguyên HA đạt khoảng 50µl/ml.

- Xử lý các mẫu thử nghiệm và kháng nguyên chuẩn đã pha lỗng bằng dung dịch Zwittergent 10% (450µl mẫu và 50 µl Zwittergent 10%).

- Tiếp tục pha lỗng các mẫu đã xử lý với Zwittergent ở trên bằng dung dịch PBS 0,01M theo bảng dƣới.

Bảng 2.4. Pha loãng mẫu thử nghiệm và kháng nguyên chuẩn Độ pha lỗng Thể tích (µl) Độ pha lỗng Thể tích (µl)

Mẫu đã xử lý với Zwittergent PBS

1,0 200 0

0,75 150 50

0,5 100 100

0,25 50 150

* Nhỏ mẫu

- Nhỏ 20µl các nồng độ pha loãng kháng nguyên chuẩn và mẫu thử nghiệm trên vào một giếng theo sơ đồ đánh số ngẫu nhiên.

- Chờ giếng khô.

- Ủ phiến trong hộp ẩm ở nhiệt độ 20-25oC trong ít nhất 18 giờ.

* Xử lý phiến

- Rửa giếng bằng nƣớc cất. Đặt miếng giấy lọc lên mặt gel, loại bỏ hết các bọt khí, sau đó đặt lên một lớp giấy thấm.

- Ép gel bằng miếng kính nặng 620g trong 30 phút - Sấy khơ gel bằng tủ ấm 37±1oC, có quạt thơng gió.

- Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm Comasie Blue 0,3% từ 5 đến 10 phút. - Tẩy màu bằng dung dịch tẩy trong 15-30 phút cho đến khi có thể nhìn rõ các vịng trịn khuyếch tán, để khô.

- Đo đƣờng kính vịng trịn khuyếch tán (lấy trung bình của 2 đƣờng kính vng góc nhau)

- Dùng phần mềm excel để tính hàm lƣợng HA của các mẫu theo từng phiến, kết quả cuối cùng là trung bình cộng kết quả của 2 phiến

- Dựng đƣờng thẳng tuyến tính

- Căn cứ vào diện tích vịng trịn khuyếch tán và độ pha lỗng của các kháng ngun, dựng đƣờng thẳng tuyến tính có dạng y=ax+b

(Yêu cầu: hệ số tƣơng quan r2≥0,95)

- Căn cứ theo đƣờng thẳng tuyến tính của kháng nguyên chuẩn, tính hàm lƣợng HA có trong các mẫu thử.

2.2.4. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein tổng số [47]

Nguyên lý

Protein trong vắcxin đƣợc tủa bằng Tricloacetic acid (TCA) rồi định lƣợng theo phƣơng pháp Lowry.

Các bước tiến hành

 Đánh dấu các ống nghiệm

 Pha dung dịch albumin chuẩn

- Pha dung dịch albumin chuẩn 25 µl/ml: Hút 0,25 ml dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml vào ống nghiệm. Thêm 9,75 ml nƣớc cất pha tiêm vào ống nghiệm trên, lắc đều.

- Pha dung dịch albumin chuẩn 50 µl/ml: Hút 0, 5 ml dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml vào ống nghiệm. Thêm 9,5 ml nƣớc cất pha tiêm vào ống nghiệm trên, lắc đều.

- Pha dung dịch albumin chuẩn 100 µl/ml: Hút 1 ml dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml vào ống nghiệm. Thêm 9 ml nƣớc cất pha tiêm vào ống nghiệm trên, lắc đều.

- Pha dung dịch albumin chuẩn 150 µl/ml: Hút 1,5 ml dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml vào ống nghiệm. Thêm 8,5 ml nƣớc cất pha tiêm vào ống nghiệm trên, lắc đều.

 Chuẩn bị mẫu thử - Lắc kỹ mẫu thử

 Pha các dung dịch thử nghiệm

- Dung dịch A: Hòa tan 0,4 g NaOH vào khoảng 40 ml nƣớc cất. Thêm 2g natri cacbonat vào dung dịch trên, khuấy cho tan hồn tồn, chuyển dung dịch sang bình định mức 50 ml, thêm nƣớc cất vừa đủ đến vạch.

- Dung dịch đồng alkalin: Hút 0,5 ml dung dịch CuSO4 2% vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml dung dịch natri tactrat 4% vào ống nghiệm trên, lắc đều. Trộn vào 50 ml dung dịch A, khuấy đều.

- Pha dung dịch thuốc thử Folin 1:1 (pha ngay trƣớc khi dùng): Pha loãng 5 ml dung dịch thuốc thử folin bằng 5ml nƣớc cất, lắc đều.

 Tiến hành

- Hút 1ml nƣớc cất và các dung dịch albumin chuẩn 25 µl/ml, 50 µl/ml, 100 µl/ml, 150 µl/ml vào các ống nghiệm đã đánh số.

- Hút 1 ml mẫu thử vào các ống nghiệm khác.

- Thêm 1ml dung dịch TCA 10% vào tất cả các ống nghiệm, lắc đều. - Đun cách thủy ở 80oC trong 15 phút. Làm nguội ở nhiệt độ phòng. - Thêm 0,5 ml dung dịch nhôm hydroxyt vào các ống nghiệm, lắc đều. - Ly tâm 3500 vòng/ phút trong 30 phút, loại nƣớc nổi.

- Bổ sung 2 ml TCA 5% vào mỗi ống nghiệm, lắc kỹ. - Ly tâm 3500 vòng/ phút trong 30 phút, loại nƣớc nổi.

- Thêm 2,5ml dung dịch đồng alkalin vào mỗi ống nghiệm, lắc kỹ. - Để ở nhiệt độ phòng qua đêm.

- Thêm 2,5ml nƣớc cất vào mỗi ống nghiệm, lắc đều.

- Bổ sung 0,5 ml thuốc thử Folin 1:1 vào mỗi ống nghiệm, lắc đều. - Đun cách thủy 37oC trong 30 phút, để nguội.

- Ly tâm 3500 vòng/ phút trong 30 phút.

- Lấy nƣớc nổi đo mật độ quang ở bƣớc sóng 750nm.

Kết quả

- Dựng đƣờng chuẩn: Căn cứ vào độ hấp phụ của dung dịch albumin chuẩn và hàm lƣợng albumin tƣơng ứng để dựng phƣơng trình đƣờng chuẩn. Xử lý số

liệu theo chƣơng trình vẽ đồ thị trong Exel của máy tính, xây dựng đƣợc phƣơng trình hồi quy tuyến tính thực nghiệm (phƣơng trình đƣờng chuẩn) y= ax + b. Dựa theo phƣơng trình tính ra hàm lƣợng protein trong mẫu thử.

- Tính kết quả

Cơng thức: Y = n x y

Trong đó: Y: Hàm lƣợng protein có trong mẫu thử (µl/ml). y = ax + b

y: Hàm lƣợng protein (µl/ml).

x: Độ hấp phụ quang đo đƣợc tƣơng ứng với mỗi nồng độ protein

a, b: Hệ số của phƣơng trình đƣờng chuẩn n: Độ pha loãng mẫu.