CHƢƠNG 2 : ĐỀ TÀI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
2.1. tài, mục tiêu và nhiệm vụ
2.1.1. Tên đề tài:
Các loài trong chi Hedychium rất hấp dẫn bởi hƣơng thơm của hoa và những hợp chất có hoạt tính sinh học thú vị thuộc dãy các - lacton diterpen , không no. Đặc biệt là các γ-lacton α, β không no thuộc dãy labdan. Các hợp chất này theo Kumakara AB và cộng sự là những hợp chất khơng chỉ có tác dụng ức chế sự tạo thành tác nhân gây ƣng thƣ và nhiều bệnh nguy hiểm khác nhƣ là NF-kB hoạt động mà cịn có tác dụng ức chế sự hoạt động của tác nhân này gây bệnh tật. Chính đặc tính lƣỡng dụng này mà các γ-lacton α, β không no thuộc dãy labdan ditecpen đang là đối tƣợng đƣợc các nhà khoa học trên thế giới đặc biệt quan tâm nghiên cứu. Chúng tôi càng quan tâm các hợp chất này và tìm kiếm nó trong các cây thuộc chi Ngải (Hedychium). Trong cơng trình trƣớc chúng tôi đã nghiên cứu các labdan ditecpen có hoạt tính gây độc tố tế bào ƣng thƣ trong cây ngải tiên (Hedychium coronarium Koen) [6]. Trong cơng trình này chúng tơi chọn cây ngải tiên Bousigon và tên đề tài: “Góp phần nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong
thân rễ cây ngải tiên bousigon ( Hedychium bousigonianum Pierre ex Gagn) ‖.
2.1.2. Mục tiêu của đề tài
a. Nghiên cứu thành phần hóa học của thân rễ cây ngải tiên bousigon.
b. Nghiên cứu, phân lập, xác định cấu trúc phân tử và hoạt tính chống ung thƣ của các - lacton , không no dãy labdan diterpene trong thân rễ ngải tiên bousigon.
2.1.3. Nhiệm vụ của đề tài
1. Nghiên cứu tinh dầu của thân rễ cây ngải tiên bousigon.
3. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các sản phẩm chiết đƣợc. 4. Nghiên cứu phân lập các - lacton , không no trong các cặn chiết từ thân
rễ cây ngải tiên bousigon.
5. Khảo sát invitro hoạt tính gây độc tế bào của 3 loại ƣng thƣ của các sản phẩm phân lập đƣợc.
6. Xác định cấu trúc phân tử của các chất phân lập đƣợc.
2.2. Các phương tiện nghiên cứu
2.2.1. Thiết bị nghiên cứu
- Sắc kí lớp mỏng: dùng bản mỏng tráng sẵn của MERCK: 60 F254. - GC-MS đo bằng máy GC-6890 MS-5973.
- Phổ hồng ngoại (IR) ghi trên máy impact 410 –Nicolet 760 FT-IR (theo phƣơng pháp ép viên KBr).
- Phổ khối lƣợng (MS) ghi trên máy Hewlett Packard HP5890, Serie II.
- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR, 13C-NMR, 13C-NMR-DEPT- 135, 13C-NMR-DEPT-90, COSY, HMQC, HMBC, đƣợc ghi trên máy Brucker Advance-500 MHz, chuẩn nội TMS (tetrametyl silan), độ chuyển dịch hóa học (δ) đƣợc biểu thị bằng ppm, hằng số J tính theo Hz.
. Các phổ đƣợc thực hiện tại Viện hóa học, Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam và Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên.
2.2.2. Dụng cụ
- Cột chiết nhồi silica gel - Bộ chƣng cất tinh dầu
- Sắc kí cột nhồi silica gel ( Hãng Merk, kích thƣớc hạt 60 đến 100m, 15 đến 40 µm).
- Sắc kí lớp mỏng dùng silica gel tráng trên các tấm kính 3 x 10 cm, dùng silica gel G5-20, hoạt hóa ở 1100C trong 2h hoặc dùng bản mỏng nhôm tráng silica gel 60F.254.
2.2.3. Các hóa chất
Các dung mơi, thuốc thử và các hóa chất khác đều dùng của hãng MERCK hay của Trung Quốc loại RA. Nếu là dung mơi cơng nghiệp thì phải xử lý nhƣ sau:
- Dung môi etylaxetat kỹ thuật đƣợc rửa axit 3 lần với dung dịch Na2CO3 5%, sau đó đƣợc rửa bằng nƣớc cất đến pH = 7. Làm khô bằng Na2SO4 khan, CaSO4 khan, cất lấy etylaxetat ở phân đoạn có nhiệt độ sơi 76-780
C.
- Dung môi n-hexan kỹ thuật đƣợc rửa bằng axit H2SO4 đậm đặc, sau đó bằng nƣớc cất đến pH= 7, làm khô bằng Na2SO4 khan và cất lấy ở phân đoạn có nhiệt độ sơi 67-680C.
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) đƣợc chạy trên những bản nhôm tráng sẵn silica gel 60F254 độ dày 0,2mm của hãng Merck.
Các sắc kí đồ lớp mỏng nhận biết bằng thuốc thử vanillin/H2SO4 1% (dùng để nhận biết các nhóm chất nhƣ steroit, tecpenoit, các chất màu, chất sáp…). Thuốc thử đƣợc điều chế nhƣ sau: cho 0,2g vanillin vào 10ml H2SO4 đặc 98% khuấy đến tan hết, thu đƣợc dung dịch thuốc thử. Thuốc hiện màu FeCl3 1M (pH=4) (dùng để nhận biết các loại hợp chất flavonoid, phenolic, axit, este…)
Chất hấp phụ dùng trong q trình sắc kí cột là silica gel cỡ hạt 0,040-0,063 mm, 0,015-0,040 mm của hãng Merck.
2.3. THỰC NGHIỆM
2.3.1. Mẫu thực vật và phương pháp xử lí:
Nguyên liệu thân rễ cây ngải tiên bousigon (Hedychium bousigonianum Pierre ex Gagn) đƣợc Tiến sĩ Nguyễn Quốc Bình ở Bảo Tàng thiên nhiên Việt Nam cung cấp và giám định. Mẫu thân rễ ngải tiên bousigon đƣợc lấy tại tỉnh Vĩnh Phúc vào tháng 4 năm 2011. Sau khi thu mua về, mẫu đƣợc rửa sạch đất cát, loại bỏ phần thối rữa, hƣ hỏng và thái ngang thân rễ thành lát dày 1- 3 mm, rồi nghiền thành bột cỡ hạt 1 – 2 mm và bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành nghiên cứu.
2.3.2. Điều chế tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon.
a/ Cho 0,2 kg nguyên liệu (đã chuẩn bị ở phần 2.3.1) cùng 2,5 lít dung dịch NaCl 10% cho vào bình cất A của thiết bị chƣng cất đặc biệt (hình 2.1) có bẫy tinh dầu D bằng 60ml dung mơi toluen.
Hình 2.1: Thiết bị cất cuốn hơi nƣớc hồi lƣu. Đun hồi lƣu 03 giờ, lấy toluen trong bẫy ra và cất lấy dịch dầu – nƣớc cho đến khi âm tính với KmnO4 0,2%.
b/Bão hòa dịch dầu-nƣớc cất đƣợc bằng NaCl rồi chiết 03 lần bằng toluen mỗi lần 100ml.
c/ Gộp lƣợng toluen lấy trong bẫy chiết với lƣợng dịch chiết toluen từ dịch dầu nƣớc,, làm khô bằng Na2SO4, cất loại dung môi, thu hồi tinh dầu, giữ trong lọ kín và bảo quản trong tủ lạnh trƣớc khi xác định thành phần hoá học và các nghiên cứu khác. Hàm lƣợng tinh dầu đƣợc tính bằng tỉ lệ phần trăm khối lƣợng tinh dầu trên khối lƣợng mẫu khô (gam). Kết quả đƣợc 0,5g tinh dầu. Tính hiệu suất là 0,25%. Tinh dầu có màu vàng chanh nhạt, mùi thơm dễ chịu, hấp dẫn.
2.3.3. Phân tích và nhận biết các thành phần của tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon: bousigon:
Mẫu tinh dầu củ ngải tiên bousigon đƣợc phân tích trên thiết bị GC-MS (HP- 6890), cột tách HP-5 (Cross-linked 5% ME Siloxane) 30m 0,25mm 0,25m Film
A: Bình cất B: Ống nối C: Sinh hàn D: Bẫy tinh dầu E: Khóa
250oC, chế độ phân tích Split Ratio 150/l; chạy theo chƣơng trình nhiệt độ: nhiệt độ đầu 90o
C trong 5 phút, tốc độ tăng nhiệt 5o
C/phút, nhiệt độ cuối 280o
C cho đến lúc đƣờng nền phẳng.
Thành phần các hợp chất trong tinh dầu đƣợc xác định bằng cách so sánh phổ khối của chúng với phổ chuẩn trong thƣ viện máy với độ trùng lặp trên 90%.
Hàm lƣợng các thành phần đƣợc tính tốn dựa trên mối liên hệ giữa diện tích pic và lƣợng chất, kết hợp việc so sánh diện tích pic của các chất trong mẫu. Kết quả phân tích đƣợc chỉ ra trên bảng 3.1 phần kết quả thảo luận.
2.3.4. Chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ ngải tiên bousigon : bousigon :
a/ Từ 3,6 kg nguyên liệu tƣơi đã chuẩn bị ở phần 2.3.1, ngâm vào 10 lít etanol 96% trong ba ngày, lọc Busne, ngâm tiếp 2 lần nữa, mỗi lần 1,5 lít EtOH 96% lọc Busne. Gộp dịch chiết etanol, thu đƣợc 10 lít dịch lọc.
b/ Cơ dịch lọc bằng cách đun cách thủy đến cịn 1/6 thể tích . Thêm vào 4 thể tích nƣớc bão hịa muối và chiết 3 lần bằng n – hexan.
Lần 1 : 150 ml Lần 2: 150 ml Lần 3: 150 ml.
Gộp dịch chiết n – hexan, làm khô bằng Na2SO4, cất loại dung môi bằng cách thủy thu đƣợc cặn H, 3gam. Hiệu suất 0.088% tính theo nguyên liệu tƣơi.
c/ Sau khi chiết bằng n – hexan, dịch đƣợc chiết tiếp bằng diclometan, cũng tiến hành 3 lần, mỗi lần 100 ml, thu đƣợc dịch diclometan. Làm khô bằng Na2SO4 khan, cất cách thủy để loại dung môi thu đƣợc cặn C khối lƣợng 4 gam, hiệu suất 0.11 % tính theo nguyên liệu tƣơi.
d/ Sau khi chiết bằng diclometan, dịch đƣợc chiết tiếp bằng etylaxetat, cũng tiến hành 3 lần, mỗi lần 100 ml, thu đƣợc dịch etyaxetat. Làm khô bằng Na2SO4 khan, cất cách thủy để loại dung môi thu đƣợc cặn E khối lƣợng 1 gam, hiệu suất 0.027 % tính theo nguyên liệu tƣơi
2.3.5. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial activity)
Theo phƣơng pháp hiện đại của Vanden Bergher và Vlietlink (1994) tiến hành trên phiến vi lƣợng 96 giếng, kháng sinh kiểm định bao gồm: Ampixilin, Tetracylin, Amphoterilin B và Nystatin.Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm các nhóm:
- Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922);Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923).
- Vi khuẩn Gr (+) : Bacillus subtillis (ATCC 27212); Staphylococcus aureus (ATCC 12222)
- Nấm mốc : Aspergillus niger (439); Fusarium oxysporum (M42).
- Nấm sợi : Candida albicans (ATCC 7754); Saccharomyces cerevisiae (SH20) Nấm và vi khuẩn đƣợc duy trì trong mơi trƣờng dinh dƣỡng: Trupcase soya borth (TBS) cho vi khuẩn, Saboruaud dextrose borth cho nấm. Các chủng kiểm định đƣợc hoạt hóa trƣớc khi tiến hành thử nghiệm trong môi trƣờng dinh dƣỡng dịch thể (24h đối với vi khuẩn; 48h đối với nấm ).
Mẫu thử đƣợc hịa tan hồn toàn trong dung dịch DMSO 100%; 4 – 10 thang nồng độ sẽ đƣợc pha loãng ra từ dịch gốc rồi nhỏ vào phiến vi lƣợng. Vi sinh vật kiểm định sau khi hoạt hóa đƣợc hịa lỗng bằng mơi trƣờng dinh dƣỡng cho có nồng độ 0 đơn vị McLand (khoảng 108
vi sinh vật/ml ), ủ ấm 370C/24h cho vi khuẩn; 300C/48h cho nấm.
Các thử nghiệm đƣợc tiến hành tại Phịng sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viên Khoa học và Công nghệ Quốc gia.
2.3.6. Khảo sát các cặn chiết bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM)
- Chuẩn bị bản mỏng: hịa tan hồn tồn chất nghiên cứu bằng dung môi dùng để chiết sao cho dung dịch thu đƣợc không quá loãng hay quá đặc. Dùng capilla thủy tinh lấy chất rồi chấm lên bản mỏng sao cho vệt chất phải tròn, gọn, cách mép bên của bản mỏng 0,5cm, cách chân bản mỏng 0,7cm. Chiều dài bản mỏng 7cm
- Chuẩn bị dung mơi: Pha hệ dung mơi thích hợp cho vào bình sắc kí có nút nhám và lắc kĩ. Lƣợng dung môi lấy sao cho khi triển khai sắc kí lớp mỏng khơng để cho dung mơi ngập vết chất.
- Triển khai sắc ký bản mỏng: cho bản mỏng đã chấm vào bình sắc kí, bản mỏng đƣợc đặt nghiêng một góc 150. Bình sắc kí phải để n trong suốt q trình triển khai. Khi tiền tuyến dung mơi cách mép trên 0,1 cm thì lấy bản mỏng ra. Làm khơ bản mỏng, sau đó hiện vệt chất bằng các thuốc hiện thích hợp.
Tiến hành SKLM cặn H trên bản 60F254 (Merk) với hệ dung môi n- hexan/EtOAc tỉ lệ 9:1,v/v, hiện sắc phổ bằng vanilin/H2SO4 1%, bằng dung dịch FeCl3 1M (pH 4) nguội và hơ nóng.
Thực hiện tƣơng tự với cặn C với hệ dung mơi n-hexan/diclometan tỉ lệ thể
tích 1/9, kết quả cho ở bảng 3.4 và 3.5 phần kết quả và thảo luận.
2.3.7. Phân lập và xác định cấu trúc phân tử của các chất trong các cặn chiết chiết
2.3.7.1. Phân lập các chất trong cặn chiết n-Hexan.
Để phân lập các chất từ cặn chiết n-hexan chúng tôi sử dụng phƣơng pháp sắc kí cột .
a) Chuẩn bị mẫu chất phân tách:
Hòa 2 gam cặn chiết từ n-hexan ( cặn H) vào một lƣợng n-hexan đủ để tan hết, cho thêm 3 gam silica gel cỡ hạt 40-60 m, trộn kỹ, làm khô hết dung mơi.
b) Chuẩn bị cột:
Cột thủy tinh có = 3 cm, l = 70 cm, có khố và nút thuỷ tinh ở đầu và cuối cột đƣợc rửa sạch bằng axit sunfocromic, nƣớc, axeton, sấy khô. Cho 100g silica gel cỡ hạt 40 – 60 m vào 250 ml n- hexan, khuấy đều và đổ vào cột, gõ cột đến
khi khơng cịn bọt khí. Để ổn định cột đến hơn 4 tiếng mới sử dụng.
Mở khóa để dung mơi trong cột xuống ngang mặt chất hấp phụ, cho hỗn hợp chất phân tách đã chuẩn bị (phần a) lên cột rồi cho dung mơi rửa cột đến ngập chất, xử lí để loại bỏ hết bọt khí, cho một lớp bơng Silica gel mỏng để giữ yên bề mặt cột. Rửa cột bằng hệ dung môi n-hexan/EtOAc tỉ lệ 9/1 theo thể tích với tốc độ
20 giọt /phút và lấy thành các phân đoạn, mỗi phân đoạn 6 ml. Kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM và thu gom các phân đoạn chỉ cho một vệt giống hệt nhau, về Rf và màu sắc phổ với cả 2 thuốc thử vanilin/H2SO4 1% và FeCl3 1M (pH 4), các phân đoạn có thành phần giống nhau đƣợc gộp lại với nhau và đem cất đuổi dung môi để thu chất.
- Với các phân đoạn chỉ cho một vệt chất đƣợc coi là chất sạch, nếu là chất rắn thì kết tinh lại để thu đƣợc chất tinh khiết, nếu là chất lỏng thì cất lại để thu chất tinh khiết.
- Với các phân đoạn có 1 – 3 vệt và ∆Rf nhỏ thì khảo sát lại bằng SKLM để tìm hệ dung mơi thích hợp và tiến hành sắc kí cột lại để phân lập các chất tinh khiết. Bằng cách này, chúng tơi đã tiến hành thí nghiệm và đƣợc kết quả nhƣ sau:
Từ phân đoạn 100 đến phân đoạn 160 thu đƣợc một vệt tinh khiết, cô đuổi dung mơi đƣợc chất rắn kí hiệu là HB5, khối lƣợng 0,30 g, Rf = 0,79 (hệ dung môi n-hexan/EtOAc tỉ lệ thể tích 3/7) hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4. Với thuốc thử FeCl3 khi để nguội khơng màu cịn khi hơ nóng có màu xanh đen.
Từ phân đoạn 50 đến phân đoạn 70 với hệ dung môi n-hexan/EtOAc tỉ lệ thể tích 8.5/1.5, chấm trên bản mỏng cho 3 vệt rất gần nhau có Rf = 0,52; 0,72 và 0,80. Cô đuổi hết dung môi thu đƣợc dạng tinh thể lẫn dầu (bẩn). Tiếp tục tiến hành chạy cột tinh với phân đoạn này. Trộn cặn của phân đoạn 3 với 1 lƣợng silica gel vừa đủ, sấy dƣới ánh sáng tử ngoại đến khô kiệt.
Cột tinh loại nhỏ = 1 cm, l = 15 cm đƣợc nhồi ƣớt với 14 gam silica gel hòa trong hexan. Cho chất lên cột và hệ dung môi chạy cột hexan: EtOAc là 9,5:0,5. Thử SKLM với hệ dung môi triển khai 9:1. Thuốc hiện màu là vanilin thu đƣợc 3 phân đoạn có sắc phổ giống nhau.
Phân đoạn 16 đến phân đoạn 18 (Rf = 0,73 màu vàng sáng). Kí hiệu HB1. Phân đoạn 22 đến phân đoạn 26 (Rf = 0,65, màu vàng). Kí hiệu HB2. Phân đoạn 30 đến phân đoạn 32 (Rf ≈ 0,45 màu tím xanh). Kí hiệu HB3 .
Cơ đuổi dung mơi các phân đoạn thu đƣợc tinh thể HB1, HB2; chất dầu là HB3.
Kiểm tra lại SKLM, thuốc thử FeCl3 thì HB3 cho màu xanh đen khi hơ nóng.
2.3.7.2. Phân lập các chất trong cặn chiết diclometan:
Làm tƣơng tự nhƣ phần 2.3.7.1 đối với 2 g cặn C.
Rửa cột bằng hệ dung môi n-hexan /diclometan tỉ lệ 1/9 theo thể tích với tốc độ 20 giọt /phút và lấy thành các phân đoạn, mỗi phân đoạn 6 ml. Kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM và thu gom các phân đoạn chỉ cho một vệt giống hệt nhau, về Rf và màu sắc phổ với cả 2 thuốc thử vanilin/H2SO4 1% và FeCl3 1M (pH= 4). Phân đoạn từ 92 đến phân đoạn 136 sau khi hứng dung môi từ cột, thử SKLM với thuốc thử vanilin/H2SO4 1% trên bản mỏng thấy xuất hiện các chấm trịn màu tím, hơ nóng màu đen, giống nhau Rf = 0,76 trong hệ dung môi CH2Cl2/CH3OH theo tỷ lệ thể tích 7/3, tiến hành cất đuổi dung mơi thu đƣợc một dạng keo dẻo. Kết tinh lại trong axeton đƣợc tinh thể màu trắng. Kí hiệu là HB7.
2.3.8. Các hằng số vật lí và các số liệu phổ của các chất thu được.
Hợp chất HB3, dạng dầu không màu, Rf =0,45 (n- hexan/EtOAc 9/1, v/v), hiện màu xanh đen với FeCl3 1M (pH=4) khi nóng. Phổ IR của HB3 max,cm-1
3086, 1681, 954 và 860. EIMS , m/z = 331,7 (M+). 13C-NMR (500 MHz,250 MHz),