CHƢƠNG 2 : ĐỀ TÀI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
2.3. THỰC NGHIỆM
2.3.7. Phân lập và xác định cấu trúc phân tử của các chất trong các cặn chiết
chiết
2.3.7.1. Phân lập các chất trong cặn chiết n-Hexan.
Để phân lập các chất từ cặn chiết n-hexan chúng tôi sử dụng phƣơng pháp sắc kí cột .
a) Chuẩn bị mẫu chất phân tách:
Hòa 2 gam cặn chiết từ n-hexan ( cặn H) vào một lƣợng n-hexan đủ để tan hết, cho thêm 3 gam silica gel cỡ hạt 40-60 m, trộn kỹ, làm khô hết dung môi.
b) Chuẩn bị cột:
Cột thủy tinh có = 3 cm, l = 70 cm, có khố và nút thuỷ tinh ở đầu và cuối cột đƣợc rửa sạch bằng axit sunfocromic, nƣớc, axeton, sấy khô. Cho 100g silica gel cỡ hạt 40 – 60 m vào 250 ml n- hexan, khuấy đều và đổ vào cột, gõ cột đến
khi khơng cịn bọt khí. Để ổn định cột đến hơn 4 tiếng mới sử dụng.
Mở khóa để dung mơi trong cột xuống ngang mặt chất hấp phụ, cho hỗn hợp chất phân tách đã chuẩn bị (phần a) lên cột rồi cho dung mơi rửa cột đến ngập chất, xử lí để loại bỏ hết bọt khí, cho một lớp bơng Silica gel mỏng để giữ yên bề mặt cột. Rửa cột bằng hệ dung môi n-hexan/EtOAc tỉ lệ 9/1 theo thể tích với tốc độ
20 giọt /phút và lấy thành các phân đoạn, mỗi phân đoạn 6 ml. Kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM và thu gom các phân đoạn chỉ cho một vệt giống hệt nhau, về Rf và màu sắc phổ với cả 2 thuốc thử vanilin/H2SO4 1% và FeCl3 1M (pH 4), các phân đoạn có thành phần giống nhau đƣợc gộp lại với nhau và đem cất đuổi dung môi để thu chất.
- Với các phân đoạn chỉ cho một vệt chất đƣợc coi là chất sạch, nếu là chất rắn thì kết tinh lại để thu đƣợc chất tinh khiết, nếu là chất lỏng thì cất lại để thu chất tinh khiết.
- Với các phân đoạn có 1 – 3 vệt và ∆Rf nhỏ thì khảo sát lại bằng SKLM để tìm hệ dung mơi thích hợp và tiến hành sắc kí cột lại để phân lập các chất tinh khiết. Bằng cách này, chúng tơi đã tiến hành thí nghiệm và đƣợc kết quả nhƣ sau:
Từ phân đoạn 100 đến phân đoạn 160 thu đƣợc một vệt tinh khiết, cô đuổi dung mơi đƣợc chất rắn kí hiệu là HB5, khối lƣợng 0,30 g, Rf = 0,79 (hệ dung môi n-hexan/EtOAc tỉ lệ thể tích 3/7) hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4. Với thuốc thử FeCl3 khi để nguội khơng màu cịn khi hơ nóng có màu xanh đen.
Từ phân đoạn 50 đến phân đoạn 70 với hệ dung môi n-hexan/EtOAc tỉ lệ thể tích 8.5/1.5, chấm trên bản mỏng cho 3 vệt rất gần nhau có Rf = 0,52; 0,72 và 0,80. Cô đuổi hết dung môi thu đƣợc dạng tinh thể lẫn dầu (bẩn). Tiếp tục tiến hành chạy cột tinh với phân đoạn này. Trộn cặn của phân đoạn 3 với 1 lƣợng silica gel vừa đủ, sấy dƣới ánh sáng tử ngoại đến khô kiệt.
Cột tinh loại nhỏ = 1 cm, l = 15 cm đƣợc nhồi ƣớt với 14 gam silica gel hòa trong hexan. Cho chất lên cột và hệ dung môi chạy cột hexan: EtOAc là 9,5:0,5. Thử SKLM với hệ dung môi triển khai 9:1. Thuốc hiện màu là vanilin thu đƣợc 3 phân đoạn có sắc phổ giống nhau.
Phân đoạn 16 đến phân đoạn 18 (Rf = 0,73 màu vàng sáng). Kí hiệu HB1. Phân đoạn 22 đến phân đoạn 26 (Rf = 0,65, màu vàng). Kí hiệu HB2. Phân đoạn 30 đến phân đoạn 32 (Rf ≈ 0,45 màu tím xanh). Kí hiệu HB3 .
Cơ đuổi dung môi các phân đoạn thu đƣợc tinh thể HB1, HB2; chất dầu là HB3.
Kiểm tra lại SKLM, thuốc thử FeCl3 thì HB3 cho màu xanh đen khi hơ nóng.
2.3.7.2. Phân lập các chất trong cặn chiết diclometan:
Làm tƣơng tự nhƣ phần 2.3.7.1 đối với 2 g cặn C.
Rửa cột bằng hệ dung môi n-hexan /diclometan tỉ lệ 1/9 theo thể tích với tốc độ 20 giọt /phút và lấy thành các phân đoạn, mỗi phân đoạn 6 ml. Kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM và thu gom các phân đoạn chỉ cho một vệt giống hệt nhau, về Rf và màu sắc phổ với cả 2 thuốc thử vanilin/H2SO4 1% và FeCl3 1M (pH= 4). Phân đoạn từ 92 đến phân đoạn 136 sau khi hứng dung môi từ cột, thử SKLM với thuốc thử vanilin/H2SO4 1% trên bản mỏng thấy xuất hiện các chấm trịn màu tím, hơ nóng màu đen, giống nhau Rf = 0,76 trong hệ dung mơi CH2Cl2/CH3OH theo tỷ lệ thể tích 7/3, tiến hành cất đuổi dung môi thu đƣợc một dạng keo dẻo. Kết tinh lại trong axeton đƣợc tinh thể màu trắng. Kí hiệu là HB7.
2.3.8. Các hằng số vật lí và các số liệu phổ của các chất thu được.
Hợp chất HB3, dạng dầu không màu, Rf =0,45 (n- hexan/EtOAc 9/1, v/v), hiện màu xanh đen với FeCl3 1M (pH=4) khi nóng. Phổ IR của HB3 max,cm-1
3086, 1681, 954 và 860. EIMS , m/z = 331,7 (M+). 13C-NMR (500 MHz,250 MHz), chuẩn nội TMS, CDCl3. Số liệu đƣợc ghi trên bảng 3.6
HB5 là chất rắn, không màu, khối lƣợng 50 mg, Rf = 0,79 (hệ dung mơi n- hexan/EtOAc tỉ lệ thể tích 3/7) hiện màu tím với thuốc thử vanilin/H2SO4 1%. Với thuốc thử FeCl3 khi để nguội khơng màu cịn khi hơ nóng có màu xanh đen. Phổ IR: 3636, 3083, 2932, 2855, 1758, 1674, 948, 892. EIMS (m/z) [M+]: 318. Số liệu phổ
1
H (500MHz) và 13C-NMR(125MHz) với chuẩn nội TMS, dung môi CDCl3. Số liệu đƣợc ghi trên bảng 3.7
Hợp chất HB7, chất rắn không màu, Rf =0,76 (CH2Cl2 /CH3OH 7/3, v/v), hiện màu đen với thuốc thử vanilin/H2SO4 1% khi nóng. Phổ IR của HB7 max,cm-1 3542.06, 1710.80, 1073.52 và 983.28. EIMS , m/z = 387,4 (M+). 13C-NMR (500 MHz,250 MHz), chuẩn nội TMS, MeOH. Số liệu đƣợc ghi trên bảng 3.8.
2.3.9. Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được:
Theo phƣơng pháp của Skehan & CS (1990) và Likhiwitayawuid & CS(1993) hiện đang đƣợc áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thƣ Quốc gia của Mỹ (NCI) và trƣờng đại học Dƣợc, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ.
Dòng tế bào
Dòng Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma - Ung thƣ gan) Lu (Lung cancer - Ung thƣ phổi)
Dòng RD (ung thƣ cơ vân tim - Rhabdosarcoma) từ Viện VSDT TƢ Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoặc MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt) Có bổ xung L- glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF(Penixillin- Streptomycin sulfate- Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum)
Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA(Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic.
Các dụng cụ dùng 1 lần: Bình ni cấy tế bào, phiến vi lƣợng 96 giếng, pipet
pasteur, các đầu tuýp cho micropipet…
Chất chuẩn chứng dương tính: Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Ellipithine, Vinblastine hoặc Taxol pha trong DMSO
- Đọc trên máy ELISA ở bƣớc sóng 495-515nm
Tính kết quả:
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo đƣợc của chúng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS(%) theo cơng thức:
OD (mẫu) – OD (ngày 0)
CS% = x 100 OD (DMSO) – OD (ngày 0)
Giá trị CS% sau khi tính theo cơng thức trên, đƣợc đƣa vào tính tốn Excel để tìm ra % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử đƣợc lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan nhƣ sau: Độ lệch tiêu chuẩn
(xi - x )2
=
n - 1
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ đƣợc chọn ra để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50
Giá trị IC50 : dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chƣơng trình Table curve theo thang gía trị logarit của đƣờng cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50. Cơng thức: 1/y=a+blnX
Trong đó Y: nồng độ chất thử; X: Giá trị CS (%). Đồ thị tính giá trị IC50 của
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đối tượng và đề tài nghiên cứu:
Nhƣ phần tổng quan đã trình bày NF-κB hoạt hóa là nguyên nhân của bệnh ƣng thƣ và nhiều bệnh khác. Trong những năm đầu thế kỉ 21 này ngƣời ta phát hiện ra rằng các γ-lacton-α,β khơng no dãy labdan ditecpen khơng những có tác dụng ức chế sự tạo thành của NF-κB hoạt động mà nó cịn có tác dụng loại trừ sự hoạt động của NF-κB. Chính vì vậy chúng là chất có hoạt tính chống ƣng thƣ mạnh, là đối tƣợng nghiên cứu của các nhà khoa học tiên tiến trên thế giới và cũng là đối tƣợng nghiên cứu của chúng tôi. Các công bố mới nhất cho thấy các loài thuộc chi Ngải (Hedychium) là nguồn nguyên liệu cho hợp chất γ-lacton-α,β không no dãy labdan ditecpen.
Các năm trƣớc chúng tôi đã nghiên cứu các γ-lacton-α,β không no dãy labdan và hoạt tính gây độc tế bào ƣng thƣ trong thân rễ cây ngải tiên (Hedychium coronarium Koen) [6]. Nhằm hoàn thiện nghiên cứu hóa học các lồi thuộc chi Hedychium và tìm kiếm các γ-lacton-α, β khơng no dãy labdan ditecpen chúng tôi tiến hành nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh hoạt trong cây ngải tiên Bousigon với đề tài:― Góp phần nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học
trong thân rễ cây ngải tiên bousigon ( Hedychium bousigonianum Pierre ex Gagn) ‖ . Đối tƣợng chúng tôi nghiên cứu là thân rễ cây ngải tiên bousigon đƣợc
thu mua vào tháng 4/2011 tại Vĩnh Phúc. Mẫu cây do TS. Nguyễn Quốc Bình– cán bộ của Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, ngƣời có bề dày thâm niên nghiên cứu họ gừng (Zingiberaceae) thu mua mẫu, giám định và cung cấp.
3.2. Nghiên cứu tinh dầu của thân rễ cây ngải tiên bousigon:
Ngải tiên Bousigon có nhiều ờ Đà Lạt, Vĩnh Phúc và Sapa, các vùng khác hầu nhƣ khơng có. Bộ phận sử dụng chủ yếu của các lồi Hedychium là thân rễ. Vì thế thân rễ của ngải tiên Bousigon là đối tƣợng nghiên cứu của chúng tơi. Rễ thân cây ngải tiên Bousigon có mùi thơm dễ chịu và quyến rũ vì vậy quan tâm đầu tiên của chúng tôi là tinh dầu của rễ cây này. Hơn nữa trong các tài liệu chúng tôi thu
thập đƣợc chƣa thấy tài liệu nào công bố về thành phần hóa học của tinh dầu thân rễ cây này.
3.2.1. Điều chế tinh dầu thân rễ ngải tiên Bousigon:
Kinh nghiệm nghiên cứu tinh dầu cho thấy hầu hết tinh dầu của thân rễ là sesquitecpen, ditecpen và dẫn xuất oxi của chúng. Các hợp chất này thƣờng có nhiệt độ sơi cao, vì vậy các phƣơng pháp cất cuốn hơi nƣớc thông thƣờng không cho hiệu suất tốt. Hơn nữa tinh dầu thuộc loại này thƣờng phân bố rải rác và liên kết với cơ chất nên cũng gây trở ngại cho cất cuốn hơi nƣớc. Để khắc phục hai nhƣợc điểm trên và cất cuốn hơi nƣớc triệt để tinh dầu trong thân rễ cây ngải tiên Bousigon, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp cất cuốn đặc biệt (xem hình 2.1) và thực hiện trong một thiết bị cho phép đun hồi lƣu để phá liên kết của tinh dầu với cơ chất, dùng hiệu ứng muối NaCl để nâng cao nhiệt độ bình cất trên 1000C. Với phƣơng pháp này từ 200g bột thân rễ ngải tiên Bousigon cho 0,5g tinh dầu màu vàng chanh, mùi thơm dễ chịu, hiệu suất 0,25% tính theo nguyên liệu khô. Kết quả này cho thấy hàm lƣợng tinh dầu trong thân rễ cây ngải tiên bousigon khơng thấp.
3.2.2. Phân tích và nhận biết các thành phần của tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon: bousigon:
Đối với chất lỏng dễ bay hơi và nhiệt độ sôi thấp nhƣ tinh dầu thì phƣơng pháp hiện đại nhất để phân tích và nhận biết các thành phần là phƣơng pháp sắc kí khí kết hợp với khối phổ. Theo phƣơng pháp này, chạy theo chƣơng trình nhiệt độ: Nhiệt độ đầu 900C, gia nhiệt 50C /phút đến 2800
C trên máy GC-6890 MS-5973, chúng tôi xác định trong tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon khơ có 45 thành phần (xem phụ lục số 1), chúng tôi đã nhận dạng đƣợc 21 thành phần là những thành phần có độ trùng lặp về phổ khối trên 90% so với phổ khối các chất trong thƣ viện máy (xem bảng 3.1).
Bảng 3.1: Các thành phần chính của Tinh dầu thân rễ cây ngải tiên bousigon vùng Vĩnh Phúc
STT Thời
gian lƣu Tên chất
Hàm lƣợng (%) Độ trùng lặp(%) 1 4.29 Iso-amylacetate 0.27 90 2 8.11 1,8-cineole 6.49 99 3 9.38 Linalool oxid 0.67 91 4 9.87 Trans-Linalool oxid 0.60 91 5 10.32 Linalool 22.31 97 6 12.43 Borneol L 1.15 90 7 12.80 14,66-terpinen-4-ol 1.1 93 8 13.27 α-terpineol 3.0 91 9 13.39 15,56-myrtenal 0.84 97 10 13.45 Myrtenal bicyclo 1.84 96 11 16.83 19,94 perilla ancol 0.41 95 12 17.09 20,14 carvacrol 0.69 93 13 24.40 Piperitenone 0.28 93 14 26.38 12-oxabicyclo[9,1,0]dodeca 1.06 91 15 27.07 Widdrene cyclopvopa[d]naphth 0.50 90 16 27.96 β-tumerone 4.90 97 17 28.79 36,48 -germacrone 1.01 99 18 29.90 37,94-zerubone 25.15 91 19 30.08 Drim-8-en-11-all-1-naphthalen 0.57 90 20 30.15 38,47 oxobisabolene 0.34 97 21 35.60 1,2-benzenedicarboxylic axit 0.65 94 Cộng 73.83
Kết quả trên cho thấy số thành phần xác định đƣợc chiếm 73.83%; còn 26.17% trong tinh dầu chƣa xác định đƣợc thành phần. Đây là một điều thú vị đối với tinh dầu ngải tiên bousigon, cần đƣợc nghiên cứu tiếp tục vì nó chiếm trên 1/4 lƣợng tinh dầu.
Khi so sánh thành phần chính của tinh dầu thân rễ cây ngải tiên bousigon trồng tại Vĩnh Phúc với thành phần chính của tinh dầu ngải tiên trồng tại Sapa, chúng tơi thấy có sự giống và khác nhau về thành phần và hàm lƣợng các thành phần. Điều này đƣợc thể hiện trên bảng 3.2.
Bảng 3.2: So sánh một số thành phần của tinh dầu thân rễ ngải tiên Sapa và tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon Vĩnh Phúc
Thành phần Loại (%) Tinh dầu Linalool α- Terpineol β- tumerone Nerollidol 37,94- zerubone 1,8-cineole Tinh dầu ngải tiên SaPa 23,44 12,14 - 11,86 - 2,23 Tinh dầu ngải tiên bousigon Vĩnh phúc 22,31 3,0 4,9 - 25,15 6,49
Sự khác biệt này có thể do phƣơng pháp điều chế, cũng có thể do thổ nhƣỡng và khí hậu, mùa lấy mẫu và lồi.
3.3. Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ cây ngải tiên bousigon (Hedychium bousigonianum Pierr ex Gagn). tiên bousigon (Hedychium bousigonianum Pierr ex Gagn).
3.3.1. Chiết chọn lọc các chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ ngải tiên bousigon. bousigon.
Nhƣ trong phần tổng quan cũng nhƣ mục tiêu của đề tài đã trình bày, loại hợp chất mà chúng tơi quan tâm nhất trong thân rễ cây ngải tiên bousigon là các các
những hợp chất có sự phân cực và có hoạt tính chống ung thƣ mạnh, chống oxi hóa và chống viêm. Để tìm kiếm các hợp chất này trong thân rễ ngải tiên Bousigon chúng tơi thực hiện quy trình chiết đƣợc chỉ ra trên sơ đồ 3.1.
Ng©m ví i etanol 96% ba lần, mỗi lần 3 ngày DÞch chiÕt etanol dÞch etanol + n- ớ c Dịch chiết n - hexan Lm khô bằng Na2SO4 Dịch chiết EtOAc CỈn hexan (H) 2gam, hiƯu st 0,05% CỈn EtOAc (CỈn E) 11gam, hiÖu suÊt 0,275%
4000 g bột củ t- ơi
Ngải tiên
1. Cơ quay cịn 1/6 V
2. Pha thªm 4/6 V n- í c mi b· o hßa 3. Chiết bằng n - hexan 3 lần mỗi lần 150 ml
Dịch Etanol + n- í c
ChiÕt 3 lÇn bằng EtOAc mỗi lần 100 ml
cất loạ i dung mụi
Lm khô bằng Na2SO4
cất loạ i dung môi
chiết 3 lần bằng EtOAC
Mỗi lần 100ml
Sơ đồ 3.1: Qui trình chiết các hoạt chất sinh học trong bột thân rễ ngải tiên bousigon
Kết quả trên cho thấy trong thân rễ cây ngải tiên bousigon hàm lƣợng các chất không phân cực hay kém phân cực rất thấp, 0,088% tính theo ngun liệu tƣơi; trong khi đó hàm lƣợng các chất có độ phân cực trung bình cao: 0,11% và 0.027% tính theo nguyên liệu mẫu tƣơi. Đây cũng là điều mong ƣớc của chúng tôi.
3600g bột thân rễ tƣơi ngải tiên bousigon
Cặn n-hexan (H) 3gam, hiệu suất 0.088%
Cặn diclometan (C) 4gam, hiệu suất 0.11% diclometan
Làm khô bằng Na2SO4 cất loại dung môi
Cặn EtOAc (E) 1gam, hiệu suất 0.027% Dịch chiết diclometan Dịch etanol+nƣớc Dịch chiết EtOAc 3600g bột thân rễ tƣơi
ngải tiên bousigon
Cặn n-hexan (H) 3gam, hiệu suất 0.088%
Cặn diclometan (C) 4gam, hiệu suất 0.11%
Cặn EtOAc (E) 1gam, hiệu suất 0.027% Dịch chiết diclometan Dịch etanol+nƣớc Dịch chiết EtOAc 3600g bột thân rễ tƣơi
ngải tiên bousigon
Cặn n-hexan (H) 3gam, hiệu suất 0.088%
Cặn diclometan (C) 4gam, hiệu suất 0.11%
Cặn EtOAc (E) 1gam, hiệu suất 0.027% Dịch chiết diclometan Dịch etanol+nƣớc Dịch chiết EtOAc 3600g bột thân rễ tƣơi