2.2.4. Phương pháp thu mẫu và xác định các đặc điểm lý hóa của các Biomix
Tiến hành thu mẫu sau giai đoạn ủ ban đầu tại các thời điểm 0 ngày, 15 ngày và 30 ngày. Mẫu được lấy ở 3 vị trí khác nhau của đống ủ: trên, giữa và dưới. Sau đó, trộn đều hỗn hợp được lấy để tạo một mẫu tổ hợp sử dụng cho các thí nghiệm phân tích các chỉ tiêu lý hóa và sinh học.
2.2.4.1. Phương pháp đo pH
Để đo pH của các Biomix, tiến hành cân 5 g mỗi loại Biomix, cho vào bình tam giác 250 ml, thêm 50 ml nước cất, lắc đều, để yên 10 phút. Sau đó thực hiện phép đo pH của hỗn hợp bằng máy đo pH cực chọn lọc ion (Mettler Toledo).
2.2.4.2. Phương pháp đo độ ẩm
Độ ẩm của Biomix được xác định theo phương pháp khối lượng của TCVN 6648:2000 (ISO:11465:1993).
2.2.4.3. Phương pháp xác định hàm lượng chất hữu cơ
Hàm lượng chất hữu cơ trong Biomix được xác định theo phương pháp Walkley-Black [3]. Các bước thực hiện như sau:
Mỗi Biomix cân và lấy ra 0,1 g hỗn hợp đã được rây qua rây có lỗ 0,25 mm. Tiếp theo, cho hỗn hợp vào bình tam giác loại 500 ml. Thêm 10 ml dung dịch K2Cr2O7 1N và thêm 20 ml H2SO4 đặc, lắc đều, để yên trong 30 phút. Thêm 200 ml nước cất. Thêm 1 ml chỉ thị axit phenylanthranilic. Sau đó chuẩn độ bằng dung dịch FeSO4
0,5N cho đến khi dung dịch có màu xanh lá cây. Tiến hành làm thí nghiệm với mẫu trắng (là mẫu khơng có chứa chất chuẩn).
Hàm lượng chất hữu cơ trong Biomix được xác định theo công thức sau: C (%) = N × (V0 ─ V1)/a × 0,39 × K
Trong đó:
N: là nồng độ đương lượng của muối FeSO4
V0: là thể tích muối FeSO4 dùng để chuẩn độ thí nghiệm mẫu trắng V1: là thể tích muối FeSO4 dùng để chuẩn độ mẫu thí nghiệm a: là lượng mẫu lấy để phân tích
K: là hệ số chuyển đổi từ mẫu khơ khơng khí sang mẫu khơ tuyệt đối
0,39 = 3 × 10-3 × 100% × 1,3 với 3 là đương lượng gam của C; 1,3 là hệ số bù cho q trình oxi hóa chưa hồn tồn chất hữu cơ trong phương pháp này.
2.2.4.4. Phương pháp xác định Nitơ tổng số
Hàm lượng Nitơ tổng số được xác định theo TCVN 6498-1999 (ISO 11261- 1995) Chất lượng đất − Xác định nitơ tổng − Phương pháp Kendan (Kjeldahl) cải biên và xác định bằng phương pháp Kenđan [31]. Các bước tiến hành như sau:
Đầu tiên cân 0,1 g mỗi loại Biomix đã được rây qua rây lỗ 0,25 mm, cho vào bình Kenđan khơ đặt hơi nghiêng trên bếp. Nhỏ thêm vào bình 5 ml H2SO4 đặc để vơ cơ hóa mẫu, đậy bình bằng một chiếc phễu, đun trên bếp từ từ cho đến khi ngừng thốt khói trắng và thu được dung dịch trong suốt không màu. Lấy ra để nguội. Thêm 1 ml HClO4 15%. Đun đến khi trắng cặn. Chuyển toàn bộ dung dịch thu được vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch định mức. Để lắng qua đêm.
Hút 10 ml dung dịch đem cất ammoniac (NH3).
Chuẩn bị dung dịch hấp phụ NH3: Lấy 30 ml dung dịch axit boric (H3BO3) 3% rồi cho vào bình tam giác loại 250 ml. Nhỏ vào bình 3 giọt chỉ thị Tasiro, sử dụng một lượng dư (khoảng 10 - 15 ml) kiềm mạnh NaOH 40% để cất trong vòng 5 phút. Dung dịch hấp phụ NH3 sẽ chuyển sang màu xanh. Sau khi cất xong thì dùng dung dịch HCl 0,05 N để chuẩn độ đến khi thấy xuất hiện màu tím đỏ.
Cơng thức xác định hàm lượng Nito tổng số trong Biomix: N (%) = (V1 ─ V2 ) × N × 0,0014 × 100/a Trong đó:
V1: là số ml HCl dùng để chuẩn độ mẫu phân tích V2: là số ml HCl dùng để chuẩn độ mẫu trắng N: là nồng độ đương lượng của HCl
0,0014: là số gam nitơ tương ứng với 1 ml dung dịch axit chuẩn độ (axit clohydric 0,1 M hoặc axit sulfuric 0,05 M)
a: là khối lượng mẫu Biomix tương đương với thể tích dung dịch được lấy đem đi cất Nitơ.
2.2.5. Phương pháp định danh nấm mốc
Để định danh các chủng nấm mốc, cần dựa vào các đặc điểm về hình thái khuẩn lạc và đặc điểm di truyền (dựa vào trình tự nucleotide mã hóa đoạn gen 28S rRNA).
Xác định một số đặc điểm hình thái và phân loại chủng nấm mốc bằng cách quan sát khuẩn lạc nấm mốc trên mơi trường Czapek thạch đĩa. Ni cấy trên lá kính để quan sát vi thể.
Việc xác định đặc điểm di truyền của chủng nấm mốc có hoạt tính phân hủy lignn cao được tiến hành bằng cách gửi mẫu nấm mốc đi định danh bằng phương pháp sinh học phân tử tại phịng thí nghiệm sinh học phân tử, công ty TNHH Dịch vụ và Thương mại Nam Khoa, thành phố Hồ Chí Minh. Phương pháp này dựa vào việc giải trình tự nucleotide mã hóa đoạn gen 28S rRNA sau đó trình tự này được so sánh với cơ sở dữ liệu trên trang web NCBI bằng công cụ BLAST SEARCH. Kết quả định danh nấm mốc được trình bày rõ ràng và chi tiết ở các Hình P1, Hình P2, Hình P3, Hình P4 phần phụ lục kèm theo.
2.2.6. Phương pháp xác định đặc tính sinh học của Biomix
2.2.6.1. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme phân hủy lignin
Hoạt tính enzyme phân hủy lignin được xác định theo phương pháp thử nghiệm 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone (MBTH) và 3-dimethylamino benzoic acid (DMAB) được mô tả chi tiết ở Castillo và cs. (1994) [8].
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên sự oxy hóa cặp đơi MBTH và DMAB. Theo đó, hệ enzyme phân hủy lignin xúc tác hình thành nên một hợp chất có màu tím đậm với một độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 590 nm với sự hiện diện của MBTH, DMAB và MnSO4. Phản ứng được khởi đầu bằng việc thêm vào dung dịch H2O2. Các bước tiến hành của phương pháp này được mô tả như sau.
Chuẩn bị dịch chiết xuất enzyme theo thứ tự:
- Sử dụng bình tam giác để cân 10 g (trọng lượng khơ) mẫu của mỗi Biomix. - Dung dịch đệm 100 mM succinate-lactate được thêm vào với 50 mL. - Lắc đều bình tam giác ở 100 vịng/phút trong 2 giờ.
- Thu 10 mL dịch nổi, ly tâm ở 4000 vịng/phút trong 20 phút và sau đó lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Tiến hành phản ứng: Phản ứng chứa tổng thể tích là 2 mL bao gồm: + Dung dịch 6,6 mM DMAB: 300 µL
+ Dung dịch 1,4 mM MBTH: 100 µL + Dung dịch 20 mM MnSO4: 30 µL
+ Dịch chiết enzyme trong dung dịch đệm 100 mM succinic/lactic acid (pH 4,5): 1560 µL
+ Dung dịch 10 mM H2O2: 10 µL
Phản ứng màu được đo ở bước sóng 590 nm trên máy đo quang phổ với cuvet có đường kính là 1 cm.
Cơng thức tính hoạt độ enzyme:
Hoạt độ enzyme (đơn vị/ml) = (ΔAbs/phút) x (0,002/0,053) x số ml mẫu. (Một đơn vị hoạt độ enzyme là lượng enzyme mà oxy hố được 1 µmol cơ chất trong 1 phút.)
Trong đó:
+ ΔAbs: là sự thay đổi về độ hấp thụ theo thời gian (phút). + 0,053: là hệ số hấp thụ mol của cơ chất tại bước sóng 590 nm + ε = 0,053 µM-1cm-1
Để đánh giá hoạt độ enzyme của các Biomix sau thời gian ủ 0 ngày, 15 ngày và 30 ngày, Biomix nào có hoạt độ mạnh hơn, tức là nhiều enzyme hơn. Từ đó sẽ xác định và chọn Biomix được có hoạt độ enzyme phân hủy lignin cao nhất để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Đồng thời qua đó có thể so sánh Biomix 15 ngày ủ có bổ sung chủng nấm mốc phân hủy lignin với Biomix 15 ngày ủ không bổ sung nấm phân hủy lignin.
2.2.6.2. Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật của Biomix
Số lượng VSV được xác định theo TCVN 6168:2002 thay thế cho TCVN 6168:1996.
- Nguyên tắc chung: Dựa trên phương pháp nuôi cấy trong môi trường thạch đĩa để xác định số lượng các tế bào sống của quần thể VSV bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc có trên thạch đĩa. Tiến hành pha loãng mẫu: sử dụng cối sứ đã được khử trùng để nghiền nát mẫu, cân 10 g mẫu rồi hịa vào bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lí 0,85% vơ trùng có độ pha lỗng 10-1. Tiếp tục pha lỗng để đạt được nồng độ thích hợp.
- Tiến hành cấy mẫu: Để lấy ra 1 ml lượng mẫu từ các dịch mẫu có các nồng độ pha lỗng ở trên cần dùng pipet đã được vơ trùng riêng cho từng độ pha loãng, cấy vào 1 đĩa petri chứa mơi trường thích hợp đã chuẩn bị sẵn. Mỗi độ pha loãng được cấy lặp lại 3 đĩa petri sau đó dùng que gạt vơ trùng gạt đều dịch mẫu trên bề mặt thạch. Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ và thời gian tùy thuộc từng yêu cầu của mỗi loại VSV.
- Kết quả được tính bằng cách giữ lại các đĩa có chứa khơng quá 300 khuẩn lạc ở hai độ pha loãng kế tiếp nhau với điều kiện là một trong các đĩa này có chứa ít nhất 15 khuẩn lạc. Mật độ VSV trong một đơn vị kiểm tra được tính bằng CFU trên gam (CFU/g).
Cơng thức tính:
Trong đó:
N: là số VSV (được tính bằng CFU/g)
∑C: là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa petri được giữ lại n1: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất;
n2: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai;
d: là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha lỗng thứ nhất.
- Mơi trường và điều kiện ni cấy thích hợp cho các nhóm VSV khác nhau:
+ Vi khuẩn: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn là thạch - cao thịt - pepton có thành
phần gồm: Cao thịt 5 g; Pepton 10 g; Agar 15 g; Nước cất 1 L và pH 7; Nuôi cấy ở nhiệt độ 30°C trong thời gian từ 2 - 3 ngày.
+ Xạ khuẩn: Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn là Gause có thành phần: Tinh bột
tan 20 g; K2HPO4 0,5 g; MgSO4.7H2O 0,5 g; KNO3 1,0 g; NaCl 0,5 g; FeSO4.7H2O 1,0 g; Agar 15 g; Nước cất 1 L; pH 7; Nuôi cấy ở nhiệt độ 30°C trong 5 - 7 ngày.
+ Nấm mốc: Môi trường nuôi cấy nấm mốc là môi trường PDA có thành phần:
Khoai tây 200 g; Glucose 20 g; Agar 15 g; Nước cất 1 L; pH 5 – 5,5; Nuôi cấy ở nhiệt độ 30°C trong 3 - 5 ngày.
+ VSV phân hủy cellulose: Được nuôi cấy trong mơi trường muối khống tối
thiểu chứa CMC có thành phần: Na2HPO4 2,4 g; K2HPO4 2,0 g; NH4NO3 0,1 g; MgSO4 0,01 g; CaCl2 0,01 g; CMC 1,0 g; Agar 15 g; Nước cất 1 L. Ni cấy ở nhiệt độ 30°C trong vịng 3 - 5 ngày.
+ VSV phân hủy hemicellulose: Được ni ở mơi trường muối khống tối thiểu chứa xylan có thành phần: Na2HPO4 2,4 g; K2HPO4 2,0 g; NH4NO3 0,1 g; MgSO4 0,01 g; CaCl2 0,01 g; Xylan 1,0 g; Agar 15 g; Nước cất 1 L. Nuôi cấy ở 30°C, 7 ngày.
+ VSV phân hủy lignin: Chuẩn bị mơi trường muối khống tối thiểu chứa lignin (MSM-L) có thành phần: Na2HPO4 2,4 g; K2HPO4 2,0 g; NH4NO3 0,1 g; MgSO4 0,01
1 2 (n 0,1.n ) C N d = + å
2.2.6.3. Phương pháp đánh giá hô hấp vi sinh vật của Biomix
Hô hấp của VSV được đánh giá bằng phương pháp đo lượng khí CO2 tạo ra trong vịng 24 giờ [27].
Cách tiến hành: Với mỗi mẫu Biomix đã ủ 15 ngày, lấy ra 30 g cho vào cốc đong 500 ml. Hút 10 ml dung dịch kiềm NaOH 1M vào cốc đong 100 ml. Đặt cả 2 cốc vào 1 bình nhựa, thêm 1 cốc đựng 10 ml nước cất vào bình để duy trì độ ẩm rồi đậy chặt bình. Để trong vịng 24 giờ ở nhiệt độ phịng 25°C. Sau đó dùng dung dịch HCl 1M để chuẩn độ NaOH 1M dư với chỉ thị phenolphthalein đến khi màu chuyển từ hồng sang không màu để xác định lượng CO2 do VSV sinh ra. Ngưng q trình chuẩn độ và ghi lại thể tích đã tiêu tốn.
- Tiến hành làm mẫu trắng với bình khơng chứa Biomix.
- Kết quả được tính như sau: Lượng CO2 sinh ra trong các Biomix được tính theo cơng thức:
Trong đó:
+ V1: là thể tích HCl 1M dùng để chuẩn độ mẫu trắng.
+ V2: là thể tích HCl 1M dùng để chuẩn độ mẫu (từ trong bình chứa Biomix). + CM HCl: là nồng độ mol của dung dịch HCl.
+ 44: là khối lượng phân tử của CO2.
+ : là hệ số quy đổi từ 30 g mẫu tươi làm thí nghiệm sang 100 g Biomix.
2.2.7. Phương pháp xác định sự phân hủy HCBVTV 2,4D và Cartap
Nồng độ của 2,4D và Cartap còn lại trong các Biomix sau các thời gian ủ khác nhau được xác định bằng cách lấy 10 g mẫu từ các Biomix sau đó cho vào túi zip (Hình P5 - phần phụ lục) và mang đi phân tích tại Phịng Khảo nghiệm Thuốc bảo vệ thực vật của Trung tâm Kiểm định và Khảo nghiệm thuốc bảo vệ thực vật phía Bắc, địa chỉ 149 Hồ Đắc Di - Đống Đa - Hà Nội. Thí nghiệm được tiến hành bằng phương pháp sắc khí lỏng hiệu năng cao (HPLC) sau khi chiết hỗn hợp bằng axeton đã được
2 1 2 30 ( ) 44 100 m 100 mgCO V V C HCl gBiomix = - ´ ´ ´ 30 100
axit hóa (axeton + nước + axit photphoric đặc với tỷ lệ 98:1:1 về thể tích) trên 1 g cơ chất với nồng độ 2,4D và Cartap ban đầu đều là 10 ppm với các mẫu phân tích ở các thời gian theo dõi quá trình phân hủy là 15 ngày và 30 ngày.
2.2.8. Xây dựng mô hình đệm sinh học để đánh giá hiệu quả xử lý 2,4D và Cartap
- Các Biomix:
+ Biomix 1 gồm: Đất : Rơm : Bã thải trồng nấm sò (Pleurotus pulmonarius) : Nấm mốc phân hủy lignin (Penicillium chrysogenum) (tỷ lệ 1:2:1:0,2), tổng khối
lượng 2,5 kg. Lớp đất mặt trồng cỏ dày 10 cm.
+ Biomix 2 gồm Đất : Rơm : Bã thải trồng nấm sò (Pleurotus pulmonarius)
(tỷ lệ 1:2:1), tổng khối lượng 2,5 kg. Lớp đất mặt trồng cỏ dày 10 cm.
+ Biomix 3 gồm Đất : Rơm : Than bùn (tỉ lệ 1:2:1). Lớp đất mặt trồng cỏ dày 10 cm.
- Thùng xốp đục lỗ thu nước và có giá ngăn cách lớp đất với đáy thùng để tách thu nước.
- Hóa chất 2,4D và Cartap được chuẩn bị ở dạng ngun chất (hóa chất phân tích), sau đó hịa tan 20 mg mỗi loại hóa chất vào mỗi bình chứa 2 lít nước cất để mỗi hóa chất đạt nồng độ 10 ppm.
Hỗn hợp sau khi ủ đến thời điểm có hoạt tính sinh học cao nhất (15 ngày) được chuyển vào Biobed.
+ Mơ hình đệm sinh học 1: Phun 2,4D nồng độ 10 ppm vào Biobed. + Mơ hình đệm sinh học 2: Phun Cartap nồng độ 10 ppm vào Biobed.
Theo dõi sự rò rỉ của nước khỏi Biobed, sự biến động của một số thơng số lý hố như nhiệt độ, độ ẩm, pH của Biomix trong suốt quá trình phân huỷ 2,4D và Cartap. Lấy mẫu Biomix sau 0 ngày, 15 ngày và 30 ngày để đánh giá hiệu quả phân hủy 2,4D và Cartap của mơ hình Biobed.
2.2.9. Phương pháp xử lý số liệu.
Chương 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tuyển chọn và định danh chủng nấm mốc phân hủy lignin cao 3.1.1. Kết quả tuyển chọn chủng nấm mốc phân hủy lignin cao 3.1.1. Kết quả tuyển chọn chủng nấm mốc phân hủy lignin cao
Từ 6 chủng nấm mốc có hoạt tính phân hủy lignin (ký hiệu lần lượt là N1, N2, N3, N4, N5 và N6) trong tập hợp giống sẵn có được phân lập từ rơm rạ và nuôi cấy mỗi chủng vào môi trường Czapek (Glucose : 10 g; Pepton : 5 g; Na2HPO4 : 2,4 g; K2HPO4 : 2 g; NH4NO3 : 0,1 g; MgSO4 : 0,01 g; CaCl2 : 0,01 g; Nước cất : 1 L). (chi tiết q trình ni cấy được mô tả rõ trong phần 2.2.2). Sau thời gian 7 ngày, tiến hành đánh giá hoạt độ enzyme phân hủy lignin của các chủng nấm mốc.
Kết quả được trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Hoạt độ enzyme phân hủy lignin của 6 chủng nấm mốc nghiên cứu
Chủng N1 N2 N3 N4 N5 N6
Hoạt độ
(đơn vị/kg) 18,7 173,6 3,7 7,5 11,3 7,5
Từ kết quả nêu trên cho thấy hoạt độ enzyme phân hủy lignin của chủng N2 là cao nhất đạt 173,6 đơn vị/kg, cao hơn gấp nhiều lần so với các chủng khác. Do hệ