Hình P2 : Kết quả giải trình tự và trình tự chi tiết mẫu thử
1.3. Tổng quan về VSV phân hủy lignin và khả năng phân hủy HCBVTV
Lignocelluloses là phần chính của sinh khối bởi nó là thành phần cấu trúc nổi bật của thành tế bào thực vật. Lignocellulose thường bao gồm cellulose (35% - 50%), hemicellulose (20% - 35%), và lignin (15% đến 20%) [22]. Lignin khác với cellulose và hemicellulose ở chỗ hàm lượng carbon tương đối nhiều. Khoảng trống giữa
cellulose và hemicellulose được lấp đầy bởi chất keo dính lignin. Lignin trong thành phần tế bào thực vật có chức năng như hàng rào bảo vệ giúp thực vật chống lại các tác động vật lí, hóa học và sâu bệnh ở mơi trường bên ngồi. Tuy nhiên thành phần này ngăn cản sự tiếp xúc của cellulose và hemicellulose với các tác nhân đặc hiệu làm giảm hiệu quả phân huỷ lignocellulose.
Lignin là loại hợp chất được tạo thành do phản ứng trùng ngưng từ 3 loại rượu chủ yếu là trans-p-cumarynic, trans-conniferynic và trans-cyperynic [23, 26]. Cấu trúc phân tử của lignin được thể hiện ở Hình 1.8.
Hình 1.8: Cấu trúc phân tử của lignin (p-coumaryl alcohol, coniferyl alcohol, và sinapyl alcohol)
Cũng như HCBVTV 2,4D và Cartap, Lignin là những hợp chất cao phân tử có thành phần cấu tạo phức tạp, khó chuyển hố, thời gian phân huỷ rất chậm kéo dài hàng tháng đến hàng năm. Đến nay, nhiều nghiên cứu đã chứng minh nấm (đặc biệt là nấm mục trắng) là nhóm VSV có khả năng sản xuất các enzyme phân hủy lignin cao nhất trong giai đoạn tiền xử lý lignocellulose. Cơ chế phân huỷ HCBVTV của nấm dựa trên khả năng phân huỷ các hợp chất hữu cơ khó phân hủy trong tự nhiên có thành phần phức tạp như lignin.
Nấm phân huỷ lignin tiếp cận nguồn C chính của chúng là ligninocellulose bằng cách phá huỷ cấu trúc khó phân huỷ và rất phức tạp của lignin mà bảo vệ ligninocellulose thông qua việc sinh tổng hợp các enzyme [21]. Đây là các enzyme ngoại bào và khơng đặc hiệu, vì vậy chúng có khả năng phân huỷ một loạt các chất hữu cơ mà có cùng đặc điểm với lignin. Các enzyme phân huỷ lignin có nhiều ứng dụng trong các ngành cơng nghiệp khác nhau như chuyển hố sợi bằng enzyme, tẩy màu thuốc nhuộm, nhưng đáng chú ý nhất là ứng dụng trong xử lý đất bị ô nhiễm và nước thải công nghiệp [30]. Trong số nhiều chất ô nhiễm khác nhau, các enzyme phân huỷ lignin đã phá huỷ thành công cấu trúc phức tạp của nhiều loại HCBVTV [25]. Các enzyme này bao gồm các phenol oxidase như là laccase và các peroxidase như là lignin peroxidase (LiP) và manganese peroxidase (MnP). Trong đó laccase là một enzyme chứa Cu mà chịu ảnh hưởng bởi các điều kiện như là pH và các tác nhân ức chế enzyme. Laccase hoạt động bằng cách oxy hoá một loạt các hợp chất thơm và không thơm mà được sử dụng làm chất nhận hydro. Con đường chuyển hố thơng thường là oxy hoá các hợp chất phenol để tạo ra các gốc tự do và quinone phenoxy. Một loạt các chất khác cũng có thể được oxy hố khi có mặt các chất xúc tiến (mediator). Ví dụ việc phân huỷ HCBVTV sử dụng laccase có thể được thúc đẩy khi có mặt của các chất xúc tiến oxy hoá khử (redox mediator) như là veratryl alcohol, ABTS và HBT. Lignin peroxidase có khả năng phân hủy lignin khơng vịng phenol. MnP có khả năng phân hủy lignin có vịng và khơng vịng phenol thơng qua phản ứng peroxit hóa. Nó oxy hóa Mn2+ thành Mn3+ từ đó oxy hóa các vịng phenol thành các gốc phenoxy dẫn đến phân hủy các hợp chất. Laccases cũng là enzyme tham gia vào quá trình phân hủy lignin [11].
Chlorophenols là các chất ô nhiễm có độc tính cao và khó phân huỷ. Những hợp chất này được sử dụng làm HCBVTV. Laccase, LiP và MnP tiến hành q trình oxy hố ban đầu chlorophenols và các chất chuyển hố được hình thành trong suốt quá trình phân huỷ chlorophenol như là hydroquinone và các dẫn xuất chứa nhóm methyl. MnP khống hố trực tiếp nhưng chỉ một phần 2,4-dichlorophenol (2,4-DCP) trong hệ thống vô bào. 2,4-DCP cũng được biết là bị oxy hoá bởi LiP [29]. P.
chrysosporium khoáng hoá hiệu quả 2,4-DCP và 2,4,6-trichlorophenol dưới điều kiện
phân huỷ lignin (Joshi and Gold 1993; Valli and Gold 1991). Sự sẵn có của nguồn dinh dưỡng C và oxy, sự có mặt của các enzyme phân huỷ lignin ngoại bào và sự sẵn có sinh khả dụng của các hợp chất chlorophenol là các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình phân huỷ.
Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• Đối tượng nghiên cứu: Hóa chất 2,4D và Cartap tinh khiết.
• Các loại Biomix: Có ba loại Biomix với các hợp phần khác nhau như sau:
Biomix 1: Đất : Rơm : Bã thải trồng nấm sò (Pleurotus pulmonarius): chủng
nấm mốc phân hủy lignin được tuyển chọn (Penicillium chrysogenum) theo tỷ lệ 1:2:1:0,2 về khối lượng và ký hiệu là SSSM.
Biomix 2: Đất : Rơm : Bã thải trồng nấm sò (Pleurotus pulmonarius) theo tỷ
lệ 1:2:1 về khối lượng và ký hiệu là SSS.
Biomix 3: Đất : Rơm : Than bùn theo tỷ lệ 1:2:1 về khối lượng và được ký hiệu
là SSP.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp tổng quan và nghiên cứu tài liệu.
Các tài liệu nghiên cứu liên quan đến đề tài đã được thu thập từ nhiều nguồn khác nhau như các tạp chí khoa học chuyên ngành, sách chuyên khảo và các báo cáo khoa học trong nước và quốc tế đã được đăng trên các tạp chí và các cơ sở dữ liệu đáng tin cậy. Các tài liệu tham khảo được sử dụng trong luận văn đã được trích sẩn rõ ràng.
2.2.2. Phương pháp tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính phân huỷ lignin cao
Từ 06 chủng nấm mốc (Hình 2.1) mà bước đầu sơ tuyển có hoạt tính phân hủy lignin trong tập hợp giống sẵn có được phân lập từ rơm rạ, tiến hành tuyển chọn chủng có hoạt tính phân hủy lignin cao nhất.
Tuyển chọn chủng nấm mốc phân huỷ lignin dựa vào hoạt tính enzyme phân hủy lignin của chúng. Hoạt tính enzyme phân hủy lignin được xác định dựa vào phương pháp thử nghiệm 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone (MBTH) và 3- dimethylamino benzoic acid (DMAB) được mô tả chi tiết ở Castillo và cs. (1994). Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên sự oxy hóa cặp đơi MBTH và DMAB, hệ enzyme phân hủy lignin xúc tác hình thành một hợp chất có màu tím đậm với một độ
hấp thụ cực đại tại bước sóng 590 nm trong sự hiện diện của MBTH, DMAB và MnSO4. Phản ứng được khởi đầu bằng việc thêm vào dung dịch H2O2 [8].
Hình 2.1: Ống nghiệm chứa các chủng nấm mốc trong tập hợp giống sẵn có
Tiến trình thực hiện:
- Để xác định được hoạt tính enzyme phân hủy lignin của các chủng nấm mốc, tiến hàng cấy một ống giống thạch nghiêng của mỗi chủng vào môi trường Czapek dịch thể thành phần như sau: Glucose : 10 g; Pepton : 5 g; Na2HPO4 : 2,4 g; K2HPO4 : 2 g; NH4NO3 : 0,1 g; MgSO4 : 0,01 g; CaCl2 : 0,01 g; Nước cất : 1 L
Bổ sung cơ chất là Lignin : 1 g.
N1 )
N2 N3 N4 N5
- Sau khi cấy trực tiếp các chủng trên môi trường thạch đĩa, nuôi lắc 120 vòng/phút trong vòng 6 - 7 ngày, đặt các đĩa đã cấy vào tủ ấm và giữ ở 30°C. Thu 10 mL dịch nổi, ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 20 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm.
- Tiến hành đánh giá khả năng phân huỷ lignin với phản ứng chứa tổng thể tích là 2 mL, trong đó:
+ 300 µL dung dịch 6,6 mM DMAB + 100 µL dung dịch 1,4 mM MBTH + 30 µL dung dịch 20 mM MnSO4 + 1560 µL dịch nổi vừa lọc ở trên + 10 µL dung dịch 10 mM H2O2
Phản ứng màu được đo ở bước sóng 590 nm trên máy đo quang phổ với cuvet có đường kính 1 cm. Một đơn vị hoạt độ là lượng enzyme mà oxy hóa được 1 µmol cơ chất trong 1 phút. Như vậy trong trường hợp này, cơng thức tính sẽ là:
Hoạt độ enzyme (đơn vị/ml) = (ΔAbs/phút) x (0,002/0,053) x số ml mẫu. Trong đó:
+ ΔAbs: sự thay đổi về độ hấp thụ theo thời gian (phút) + 0,053: hệ số hấp thụ mol của cơ chất tại bước sóng 590 nm + ε = 0,053 µM-1cm-1
Sau đó dựa vào hoạt độ enzyme phân hủy lignin của các chủng nấm mốc đã nuôi cấy để tuyển chọn được chủng nấm có hoạt tính cao nhất. Chủng nấm mốc được tuyển chọn sau đấy sẽ được bổ sung vào Biomix để thực hiện các bước nghiên cứu tiếp theo.
2.2.3. Phương pháp chuẩn bị các Biomix
Biomix được chuẩn bị dựa theo phương pháp của Fernández-Albertil và cs. (2012) với một số cải tiến như thay than bùn bằng bã thải trồng nấm và bổ sung chủng nấm mốc phân huỷ lignin vào Biomix [16].
2.2.3.1. Chuẩn bị các Biomix
a) b)
c) d) e)
Hình 2.2: Các thành phần nguyên liệu của Biomix
a) Đất; b) Rơm; c) Than bùn; d) Bã thải trồng nấm sò; e) Chủng nấm mốc phân hủy lignin được tuyển chọn (Penicillium chrysogenum)
- Đất bề mặt được lấy trực tiếp từ vườn trồng rau màu ở Hà Đông, Hà Nội (ở độ sâu từ 0 - 20 cm). Sau khi mang về được xử lý bằng cách để khơ trong khơng khí ở nhiệt độ phịng rồi rây qua rây có đường kính lỗ 3 mm để đồng nhất mẫu. Bảo quản đất trong túi nilon sạch, bao kín ở nhiệt độ 4 - 10oC đến khi sử dụng.
- Rơm rạ được thu từ đồng ruộng đất chiêm trũng ở Ninh Bình. Rơm rạ phải chọn loại đã thật sự khơ, sau khi mang về phịng thí nghiệm được xử lý sơ bộ để loại bỏ các tạp chất như túi nilon, sỏi, đá rồi sau đó cắt nhỏ rơm rạ thành những đoạn ngắn hơn có kích thước 2 - 3 cm để quá trình ủ được thực hiện dễ dàng và hiệu quả hơn trong việc khi hấp phụ và phân hủy HCBVTV của Biomix.
- Bã thải trồng nấm sò trắng (Pleurotus pulmonarius) được thu từ khu vực trồng nấm tại Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam - Bắc Từ Liêm - Hà Nội. Sau
khi mang về, bã nấm sò trắng được xử lý sơ bộ, sau đó nghiền nhỏ rồi rây qua rây có kịch thước lỗ 3 mm. Bảo quản trong túi nilon sạch, hút hết khơng khí, bao kín lại và để trong tủ ấm ở 4 - 10oC đến khi sử dụng.
- Than bùn sau khi mua về thì được bảo quản trong túi nilon sạch, bao kín và để trong tủ ấm ở nhiệt độ 4 - 10oC đến khi sử dụng.
- Nấm mốc phân hủy lignin (Penicillium chrysogenum) sau khi được tuyển chọn thì cho vào mơi trường PDA dịch thể với các thành phần bao gồm:
Khoai tây : 200 gam Glucose : 20 gam Agar : 20 gam Nước cất : 1000ml pH : 5 - 5,5.
Sau khi cấy, nuôi lắc 120 vòng/phút trong vòng 6 - 7 ngày ở 30°C. Thu sinh khối trong bình và tiến hành bổ sung vào Biomix với tỷ lệ 5% thành phần Biomix (tương ứng với 125 ml). Trộn đều để nấm có thể phát triển đều trong Biomix.
2.2.3.2. Phối trộn tạo các Biomix
- Chuẩn bị ba thùng xốp loại vừa có kích thước trong 45 x 32 x 28 (cm) và ba nắp thùng hoặc tấm nilon để đậy, tấm đập sẽ được làm thủng vài lỗ nhỏ tạo khơng khí cho Biomix cũng như tạo điều kiện cho VSV hiếu khí sinh trưởng và phát triển.
- Các thành phần nguyên liệu được đưa vào theo thứ tự rơm, bã thải trồng nấm sò (hoặc than bùn đối với Biomix 3), đất sau đó phối trộn đều để chuẩn bị tạo các Biomix.
- Khối lượng của một loại Biomix là 2,5 kg.
+ Biomix 1: 0,625 kg đất : 1,25 kg rơm : 0,625 kg bã thải trồng nấm sị : 125 ml dịch ni cấy chủng nấm mốc phân hủy lignin được tuyển chọn.
+ Biomix 2: 0,625 kg đất : 1,25 kg rơm : 0,625 kg bã thải trồng nấm sò. + Biomix 3: 0,625 kg đất : 1,25 kg rơm : 0,625 kg than bùn.
- Cân thành phần mỗi nguyên liệu của mỗi Biomix như trên, cho vào các thùng xốp đã được chuẩn bị từ trước, trộn đều các nguyên liệu với nhau. Sau đó, tưới nước
bằng cách phun sương để làm ẩm đến độ ẩm 60% cho cả ba Biomix và bảo quản ở nhiệt độ phòng. Các Biomix sau khi chuẩn bị xong (Hình 2.5).
Hình 2.3: Các thùng chứa các hỗn hợp Biomix hoàn chỉnh vừa tạo được
2.2.4. Phương pháp thu mẫu và xác định các đặc điểm lý hóa của các Biomix
Tiến hành thu mẫu sau giai đoạn ủ ban đầu tại các thời điểm 0 ngày, 15 ngày và 30 ngày. Mẫu được lấy ở 3 vị trí khác nhau của đống ủ: trên, giữa và dưới. Sau đó, trộn đều hỗn hợp được lấy để tạo một mẫu tổ hợp sử dụng cho các thí nghiệm phân tích các chỉ tiêu lý hóa và sinh học.
2.2.4.1. Phương pháp đo pH
Để đo pH của các Biomix, tiến hành cân 5 g mỗi loại Biomix, cho vào bình tam giác 250 ml, thêm 50 ml nước cất, lắc đều, để yên 10 phút. Sau đó thực hiện phép đo pH của hỗn hợp bằng máy đo pH cực chọn lọc ion (Mettler Toledo).
2.2.4.2. Phương pháp đo độ ẩm
Độ ẩm của Biomix được xác định theo phương pháp khối lượng của TCVN 6648:2000 (ISO:11465:1993).
2.2.4.3. Phương pháp xác định hàm lượng chất hữu cơ
Hàm lượng chất hữu cơ trong Biomix được xác định theo phương pháp Walkley-Black [3]. Các bước thực hiện như sau:
Mỗi Biomix cân và lấy ra 0,1 g hỗn hợp đã được rây qua rây có lỗ 0,25 mm. Tiếp theo, cho hỗn hợp vào bình tam giác loại 500 ml. Thêm 10 ml dung dịch K2Cr2O7 1N và thêm 20 ml H2SO4 đặc, lắc đều, để yên trong 30 phút. Thêm 200 ml nước cất. Thêm 1 ml chỉ thị axit phenylanthranilic. Sau đó chuẩn độ bằng dung dịch FeSO4
0,5N cho đến khi dung dịch có màu xanh lá cây. Tiến hành làm thí nghiệm với mẫu trắng (là mẫu khơng có chứa chất chuẩn).
Hàm lượng chất hữu cơ trong Biomix được xác định theo công thức sau: C (%) = N × (V0 ─ V1)/a × 0,39 × K
Trong đó:
N: là nồng độ đương lượng của muối FeSO4
V0: là thể tích muối FeSO4 dùng để chuẩn độ thí nghiệm mẫu trắng V1: là thể tích muối FeSO4 dùng để chuẩn độ mẫu thí nghiệm a: là lượng mẫu lấy để phân tích
K: là hệ số chuyển đổi từ mẫu khơ khơng khí sang mẫu khơ tuyệt đối
0,39 = 3 × 10-3 × 100% × 1,3 với 3 là đương lượng gam của C; 1,3 là hệ số bù cho q trình oxi hóa chưa hoàn toàn chất hữu cơ trong phương pháp này.
2.2.4.4. Phương pháp xác định Nitơ tổng số
Hàm lượng Nitơ tổng số được xác định theo TCVN 6498-1999 (ISO 11261- 1995) Chất lượng đất − Xác định nitơ tổng − Phương pháp Kendan (Kjeldahl) cải biên và xác định bằng phương pháp Kenđan [31]. Các bước tiến hành như sau:
Đầu tiên cân 0,1 g mỗi loại Biomix đã được rây qua rây lỗ 0,25 mm, cho vào bình Kenđan khô đặt hơi nghiêng trên bếp. Nhỏ thêm vào bình 5 ml H2SO4 đặc để vơ cơ hóa mẫu, đậy bình bằng một chiếc phễu, đun trên bếp từ từ cho đến khi ngừng thốt khói trắng và thu được dung dịch trong suốt không màu. Lấy ra để nguội. Thêm 1 ml HClO4 15%. Đun đến khi trắng cặn. Chuyển tồn bộ dung dịch thu được vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch định mức. Để lắng qua đêm.
Hút 10 ml dung dịch đem cất ammoniac (NH3).
Chuẩn bị dung dịch hấp phụ NH3: Lấy 30 ml dung dịch axit boric (H3BO3) 3% rồi cho vào bình tam giác loại 250 ml. Nhỏ vào bình 3 giọt chỉ thị Tasiro, sử dụng một lượng dư (khoảng 10 - 15 ml) kiềm mạnh NaOH 40% để cất trong vòng 5 phút. Dung dịch hấp phụ NH3 sẽ chuyển sang màu xanh. Sau khi cất xong thì dùng dung dịch HCl 0,05 N để chuẩn độ đến khi thấy xuất hiện màu tím đỏ.
Công thức xác định hàm lượng Nito tổng số trong Biomix: N (%) = (V1 ─ V2 ) × N × 0,0014 × 100/a Trong đó:
V1: là số ml HCl dùng để chuẩn độ mẫu phân tích V2: là số ml HCl dùng để chuẩn độ mẫu trắng N: là nồng độ đương lượng của HCl
0,0014: là số gam nitơ tương ứng với 1 ml dung dịch axit chuẩn độ (axit clohydric 0,1 M hoặc axit sulfuric 0,05 M)
a: là khối lượng mẫu Biomix tương đương với thể tích dung dịch được lấy đem đi cất Nitơ.