1 .2Cấu tạo của Coenzyme Q0
3.8 Phản ứng ghép chéo sử dụng xúc tác Grubbs2 nd
Xúc tác Grubbs được biết đến là các phức của kim loại chuyển tiếp và cacben, được dùng phổ biến trong phản ứng hốn vị olefiin. Người đầu tiên tìm ra và tổng hợp thành cơng là nhà hóa học Robert H. Grubbs29. Điển hình nhất là hai thế hệ xúc tác: Grubbs 1st và Grubbs 2nd. Ngược lại với các xúc tác hoán vị olefin khác, xúc tác Grubbs khơng ảnh hưởng đến các nhóm chức khác trong alkene, phản ứng êm dịu có thể thực hiện ở mơi trường khơng khí và đặc biệt là sử dụng được trong nhiều loại dung mơi khác nhau. Chính vì thế, xúc tác Grubbs đã trở nên phổ biến trong tổng hợp hữu cơ. So với xúc tác Grubbs 1st (RuCl2(PPh3)3), thì xúc tác Grubbs 2nd (dựa trên N-heterocyclic carben bão hòa -1,3-bis(2,4,6- trimethylphenyl)dihydroimidazole) được sử dụng rộng rãi hơn bởi vì: hoạt tính cao hơn, bền hơn ở trong mơi trường khơng khí ẩm, và dễ dàng bảo quản trong phịng thí nghiệm.
Phản ứng ghép chéo olefin là một trong những bước quan trọng nhất trong quá trình tổng hợp chất chìa khóa của dẫn xuất Coenzyme Q10. Phản ứng ghép chéo được tiến hành thực nghiệm với xúc tác Grubbs 2nd trong dung môi CH2Cl2.Nguyên nhân do trong q trình phản ứng, thốt ra 1 đương lượng khí etylen, nên khi sử dụng trong quy mô công nghiệp phải hết sức chú ý để tránh hiện tượng tăng áp suất quá lớn, gây mất an toàn khi tiến hành phản ứng. Tuy vậy, sản phẩm sau phản ứng có thể dễ dàng phân lập bằng phương pháp kết tinh lại. Bên cạnh đó, việc sử dụng xúc tác trên đã cho kết quả ngoài mong đợi, định hình lựa chọncấu hình 100% là E, điều mà các phương pháp nghiên cứu cơng bố trước đó chưa làm được. Đây cũng là tính ưu việt của phương pháp nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất Coenzyme Q10 với phản ứng hoán vị olefin sử dụng xúc tác Grubbs 2nd.
Cơ chế phản ứng: - Giai đoạn đầu tiên
- Gia đoạn hai của phản ứng
Sơ đồ 11. Cơ chế phản ứng Grubbs 2nd
Trong luận văn, đã tiến hành khảo sát tối ưu hóa các điều kiện để tăng hiệu quả trong phản ứng ghép chéo olefin.
Bảng 19. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng
STT Xúc tác (%mol) Dung môi Sản phẩm 8 (%) Sản phẩm 15 (%) 1 5 CH2Cl2 - - 2 10 CH2Cl2 35,2 46,5 3 20 CH2Cl2 32,7 37,1 4 10 Methyl methacrylate 45,4 67,6
Quan sát kết quả khảo sát ở trên ta nhận thấy: nếu hàm lượng xúc tác so với chất đầu tăng lên thì hiệu suất cũng tăng lên. Tuy nhiên khi hàm lượng hơn 10% so với chất đầu thì hiệu suất giảm xuống, nguyên nhân có thể do hiện tượng dimer hóa, hàm lượng xúc tác lớn thì thuận lợi cho phản ứng tạo dimer từ đó làm giảm hiệu suất của phản ứng. Ngồi ra, điều đặc biệt khi khơng sử dụng dung môiCH2Cl2 mà sử dụng trực tiếp methyl methacrylate (chất phản ứng) dư làm dung mơi phản ứng, thì hiệu quả phản ứng tăng lên đáng kể. Kết luận với lượng hàm lượng xúc tác 10% (mol), và dùng lượng dư chất đầu methyl methacrylate thì hiệu suất phản ứng ghép
chéo olefinxúc tác Grubbs 2nd đạt hiệu quả cao nhất, sản phẩm 8đạt hiệu suất 45,4%, sản phẩm 15 đạt hiệu suất 67,6%.
Cấu trúc của sản phẩm 8 và 15 được chứng minh thông qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C dưới đây.
Hình 17. Phổ cộng hưởng hạt nhân 1H chất 8
Quan sát và phân tích hình 17 trên, ta có bảng giải phổ các tín hiệu đặc trưng trong phổ cộng hưởng từ hạt nhân trên.
Bảng 20.Các tín hiệu đặc trưng của chất 8
δ (ppm) 7,70 7,48 6,67 3,69 3,56 2,48 2,24 2,01 Độ bội m m td s d d s s Số H 2H 2H 1H 3H 2H 6H 3H 3H Nhóm CH vòng CH vòng CH lk π -OCH3 -CH2- -CH3 acyl -CH3 lk CH=CH -CH3
Từ kết quả bảng 20, ta thấy được các tín hiệu đặc trưng ở vị trí: 6,67 ppm là của H trong liên kết –CH=; 3,69 ppm (singlet – 3H) của nhóm -OCH3; 3,56 ppm (doublet – 2H) chân rộng của –CH2–; 2,24 ppm (singlet – 3H) của nhóm –CH3 liên kết với liên kết –CH=CH–.
Phân tích với phổ cộng hưởng từ 13C chất 8[(E)-2-(4-methoxy-3-methylbut-2- en-1-yl)-3-methylnaphthalene -1,4-diyl diacetate] dưới đây.
Hình 18. Phổ cộng hưởng từ 13C chất 8
Quan sát và phân tích phổ 13C ở hình 18, ta có bảng kết quả giải phổ dưới đây: Bảng 21. Kết quả giải phổ 13C chất 8 δ(ppm) 169,21 168,14 142,79 142,67 138,70 128,41 127,91 Vị trí C CO 2CO C vòng C vòng C vòng C vòng C vòng δ(ppm) 126,8 126,68 126,53 126,48 126,14 121,45 121,28 Vị trí C C vịng C vịng C vòng C vòng C lk π C vòng C lk π δ(ppm) 51,8 27,71 20,64 20,61 13,28 12,75
Vị trí C -OCH3 CH2 CH3acyl CH3acyl CH3lkπ CH3
Từ kết quả phân tích trên và kết quả phổ cộng hưởng từ 1H chất 8, đã chứng minh được sản phẩm có cấu trúc phù hợp với mục tiêu tổng hợp.Bên cạnh đó, để chứng minh sản phẩm ghép chéo cấu hình tuyệt đối của sản phẩm, ta sử dụng phổ NOESY dưới đây.
Hình 19. Phổ NOESY chất 8
Thật vậy, từ kết quả hình 19 ở trên ta thấy rằng tín hiệu đặc trưng của nhóm - CH2 chỉ tương tác với với 2 tín hiệu (nhóm -CH3 trong liên kết π và nhóm -CH3 liên kết trực tiếp với vịng thơm) cho 2 tín hiệu nhỏ ở trên phổ. Ngồi ra khơng thấy tín hiệu tương tác nào khác, điều đó chứng minh được cấu hình của chất 8[(E)-2-(4- methoxy-3-methylbut-2-en-1-yl)-3-methylnaphthalene -1,4-diyl diacetate] là 100% cấu hình E.
Đối với sản phẩm 15 cũng với cách chứng minh cấu trúc dựa vào phổ cộng
Hình 20. Phổ cộng hưởng từ 1H của chất 15
Từ phổ proton hình 20, ta có bảng giải phổ cộng hưởng từ 1H 15 [(E)-2-(4-
methoxy-3-methylbut-2-en-1-yl)-3,5,6-trimethyl-1,4-phenylene diacetate] như sau: Bảng 22. Kết quả phổ cộng hưởng từ 1H chất 15
δ (ppm) 6,58 3,69 3,36 2,33 2,05 1,96
Độ bội td d s d d d
Số H 1H 3H 2H 6H 9H 3H
Nhóm CH lk π -OCH3 -CH2- -CH3 acyl -CH3 -CH3 Từ kết quả bảng 22, ta thấy được các peak đặc trưng ở vị trí: 6,58 ppm là của H trong liên kết –CH=; 3,69 ppm (singlet – 3H) của nhóm -OCH3;3,56 ppm (doublet – 2H) chân rộng của –CH2–. Thấy các tín hiệu phù hợp với cấu trúc chất
15 [(E)-2-(4-methoxy-3-methylbut-2-en-1-yl)-3,5,6-trimethyl-1,4-phenylene diacetate].
Hình 21. Phổ cộng hưởng từ 13C chất 15
Quan sát và phân tích phổ 13C ở hình 21 ta có bảng kết quả chất 15 [(E)-2-(4- methoxy-3-methylbut-2-en-1-yl)-3,5,6-trimethyl-1,4-phenylene diacetate] dưới đây:
Bảng 23. Kết quả giải phổ 13C chất 15
δ(ppm) 168,24 145,99 145,57 139,30 128,56 127,83 127,22 Vị trí C 3CO C vịng C vòng C vòng 2C vòng CH lk π C vòng
δ(ppm) 51,74 27,48 20,55 20,5 13,24 12,84 12,65 Vị trí C OCH3 CH2 CH3 acyl CH3 acyl CH3 CH3 CH3
Từ kết quả phân tích trên và kết quả phổ cộng hưởng từ 1H chất 15 [(E)-2-(4- methoxy-3-methylbut-2-en-1-yl)-3,5,6-trimethyl-1,4-phenylene diacetate], đã chứng minh được sản phẩm có cấu trúc đúng với mục tiêu tổng hợp.
Hình 22. Phổ NOESY chất 15
Thật vậy, từ kết quả hình 22 ở trên ta thấy rằng tín hiệuđặc trưng của nhóm - CH2 chỉ tương tác với với 2 tín hiệu đặc trưng khác (CH3 trong liên kết π và CH3 liên kết với vịng thơm) cho 2 tín hiệu nhỏ ở trên phổ. Từ đó kết luận được rằng, chất 15 (E)-2-(4-methoxy-3-methylbut-2-en-1-yl)-3,5,6-trimethyl-1,4- phenylenediacetate có 100% cấu hình E.
KẾT LUẬN
Coenzyme Q10 có vai trị hết sức quan trọng đối với sức khỏe con người, được sử dụng phổ biến như một loại thuốc chống các bệnh về tim mạch. Mặc dù Coenzyme Q10 đã được sản xuất bằng lên men vi sinh đã được áp dụng trên quy mơ cơng nghiệp, tuy nhiên vẫn chưa có sản phẩm thương mại nào đi từ con đường tổng hợp toàn phần. Với mong muốn có thể sản xuất quy mô công nghiệp bằng con đường tổng hợp, chúng tôi đã nghiên cứu thành công phương pháp tổng hợp chất chìa khóa của dẫn xuất Coenzyme Q10sử dụng 2 bước phản ứng quan trọng đó là: Chuyển vị Claisen, và phương pháp hoán vị Olefin sử dụng xúc tác Grubbs 2nd.
Chúng tôi đã tổng hợp được 2 dẫn xuất Coenzyme Q10 với cấu hình tuyệt đối là 100% E. Cấu trúc hóa học của hợp chất 8[(E)-2-(4-methoxy-3-methylbut-2-en-1-
yl)-3-methylnaphthalene -1,4-diyl diacetate] và chất 15 [(E)-2-(4-methoxy-3-
methylbut-2-en-1-yl)-3,5,6-trimethyl-1,4-phenylene diacetate] được chứng minh bởi dữ liệu cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13C và NOESY. Hiệu suất của tổng của 2 quá trình đối với chất 15 là 20,4%, chất 8 là 10,2%.Đã công bố 01 bài báo trên tạp chí
khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội.
Trong thời gian tới, chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứutối ưu hóa các điều kiện phản ứng để tăng được hiệu suất q trình tổng hợp, khảo sát và thử hoạt tính sinh học của các dẫn xuất này. Từ đó có thể nâng quy mơ phịng thí nghiệm lên thành quy mô công nghiệp, mục tiêu đưa chúng trở thành sản phẩm thương mại (những dẫn xuất có hoạt tính sinh học cao), phục vụ cho sức khỏe của con người.
CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CƠNG BỐ
Le Minh Dong, Nguyen Thu Trang, Pham Van Phong, Mac Dinh Hung, (2016), Synthesis of Key Intermediate of Coenzyme Q10 Analogues. VNU Journal of Science, 32 (3), 235-239.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Đào Thị Lương, Trần Thị Lệ Quyên (2009) Tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm
phân loại của các chủng nấm men sinh CoQ10, phân lập ở Việt Nam. Tạp chí
Di truyền học và ứng dụng, Chuyên san Công nghệ Sinh học số 5, pp. 8-14. 2. Trần Thị Lệ Quyên, Đào Thị Lương (2010) Phân loại và nghiên cứu điều
kiện ni thích hợp cho sinh trưởng và tổng hợp Coenzyme Q10 ở chủng nấm men PL5-2. Tạp chí Di truyền học và ứng dụng - Chuyên san Công nghệ sinh
học sô 6, pp.7-13.
Tiếng Anh
3. Aberg F, Appelkvist E.L, Dallner G, Ernster L. (1992),Distribution and redox
state of ubiquinone in rat and human tissue. Archives of Biochemistry and
Biophysics, 295(2), pp. 230-234.
4. B Min, D.U.Ahn.(2005), Mechanism of lipid peroxidation in meat and meat products. Food Science Biotechnology, 14, pp. 152-163.
5. CarrG, ExellG. (1965), Ubiquinone concentrations in Athiorhodaceae grown under various environmental conditions. Biochemistry, 96, pp. 688-692
6. Cheng B, YuanQ. P, LiW. (2010), Enhanced Production of Coenzyme Q10 by Overexpressing HMG-CoA Reductase and Induction with Arachidonic Acid in Schizosaccharomyces pombe. ApplyBiochemistry technology, 160, pp. 523–
531.
7. CheongS.R, Sang Y.K, JungK, HyeonX, SukJ.H. (2008), Fermentation process for preparing Coenzyme Q10 by the recombinant Agrobacterium Tumefaciens. Patent Application Publication.
8. ChoiG.S, KY.S, SeoJ. H, RyuY.W.(2005), Restricted electron flux increases Coenzyme Q10 productionin Agrobacterium tumefaciens ATCC4452. Process
9. ChoiJ, Ri Y, ParkY, SeoJ. (2009), Synergistic effects of chromosomal ispB deletion and dxs overexpression on coenzyme Q 10 production in recombinant Escherichia coli expressing Agrobacterium tumefaciens dps gene. Journal Biotechnology 144(1), pp. 64 – 69.
10. ConklinK. A.(2000), Dietary antioxidant during cancer chemotherapy: impact on chemotherapeutic effectiveness and development of side effects.
Nutrient Cancer 37(1), pp. 1–18.
11. Donald E.W, Carl H.H, Nelson R.T, Byron H.A, Clifford H.S, Bruce O.L, James F.M, Folkers K.(1958), Coenzyme Q.I. Structure studies on the coenzyme Q group. Journal American ChemistrySociety, 80, pp. 4752-4752.
12. Ernster L, Dallner G. (1995),Biochemical, physiological and medical aspects of
ubiquinone function. Biochimica et Biophysica Acta, 1271(1), pp. 195-204.
13. Eun-Taek Oh, Sangho Koo, et al.(2012)Synthesis of Coenzyme Q10. European Journal of Organic Chemistry, 26, pp. 627-637.
14. Folkers K, Vadhanavikit S,Mortensen S.A.(1985),Biochemical rationale and
myocardial tissue data on the effective therapy of cardiomyopathy with coenzyme Q10. Proceeding of the National Academy of Sciences USA, 82(3), pp. 901-904.
15. FredZ, Esther B, DanielS. (2006),Preparation and Properties of Coenzyme
Q10 Nanoemulsions. Cosmetic Science Technology.
16. Goldstein G.T, Brown M.S. (1990), Regulation of the mevalonate pathway.
Nature. 343, pp. 425-430.
17. Gozzo F.C, Fernandes S.A, Rodrigues D.C, Eberlin M.N, Marsaioli A.J. (2003),Regioselectivity in Aromatic Claisen Rearrangements. Journal of chemistry, 68, pp. 5493-5499.
18. HaS.J, Ka S.Y, Seo J.H, Moon H.J, LeeK.M, LeeJ.K. (2007b), Controlling the sucrose concentration increases Coenzyme Q10 production in fed-batch culture of Agrobacterium tumefaciens. Applied Microbiology and
19. HaS.J, Ka S.Y, Seo J.H, Ho D.K, Lee J.K. (2007a), Optimization of culture conditions and scale-up to pilot and plant scales for Coenzyme Q10 production by Agrobacterium tumefaciens. Apply Microbiol Biotechnol, 74,
pp. 974-980
20. HoppeU, BergemannaJ, DiembeckaW.(1999), Coenzyme Q10, a cutaneous antioxidant and energizer. BioFactors, 9, pp. 371–378.
21. Langsjoen P.H, Langsjoen P.H, WillisR, Folkers K. (1994), Treatment of essential hypertension with Coenzyme Q10. The Molecular Aspects of
Medicine, Vol. 15 (Supplement), pp S287-S294.
22. LangsjoenP.H, LangsjoenA.(1999), Overview of the use of CoQ10 in cardiovascular disease. Biofactors, 9(2–4), pp. 273–84.
23. Lipshutz B.H, MollardP, Pfeiffer S.S, Chrisman W.(2002). Improved synthesis of the “Miracle Nutrient”. Journal American ChemistrySociety, 124,
pp. 14282-14283.
24. Littarru G.P, Ho L, Folkers K. (1972),Deficiency of Coenzyme Q10 in human heart
disease.International Journal for Vitamin and Nutrition Research, 42(2), pp. 291-
292.
25. LiuJ, Wang L.N, Zhan S.Y, XiaY. (2012), "WITHDRAWN: Coenzyme Q10 for
Parkinson's disease". Cochrane Database Syst Rev. 5: CD008150.
26. Lockwood K, Moesgaard S, Folkers K.(1994),Partial and Complete
Regression of Breast Cancer in Patients in Relation to Dosage of Coenzyme Q10. Biochemical and Biophysical Research Communications, 99, pp. 1504–
1508.
27. Lockwood K, Moesgaard S, Yamamoto T, Folkers K.(1994), Progress on therapy of breast cancer with vitamin Q10 and the regression of metastases.Biochemical and Biophysical Research Communications, 212, pp.
172–177.
28. Lonnrot K, Metsa K.T, Molnar G, Ahonen J.P, Latvala M, Peltola J, Pietila T, Albo H.(1996), The effect of ascorbate and ubiquinone supplementation on
plasma and CSF total antioxidant capacity. Free Radical Biology and Medicine, 21,
pp. 211-217.
29. Love J.A, Sanford M.S, Day M.W, Grubbs R.H.(2003),Synthesis, Structure,
and Activity of Enhanced Initiators for Olefin Metathesis.Journal American
ChemistrySociety, 125, pp. 10103-10109.
30. Mark H.G. (2012),Coenzyme Q10 and riboflavin: the mitochondrial
connection Headache Review, 52(2), pp.81-88.
31. MatsumuraM, KobayashiT, AibaS. (1983), Anaerobic production of ubiquinone-10 by Paracoccus dentrificans. EuropeanMicrobiology Biotechnology, 17, pp. 85–89.
32. MichaelR.S (2010) Coenzyme Q10 Biosynthesis in Plants. A dissertation
submitted to the Graduate Faculty of North Carolina State University in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy. 33. Mitchell P.(1976),Possible molecular mechanisms of the protonmotive
function of cytochrome systems.Journal of Theoretical Biology, 62, pp. 327-367.
34. MiyakeY, ShouzuA, NishikawaM.(1999), Effect of treatment with 3-hydroxy-
3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors on serum Coenzyme Q10 in diabetic patients. Arzneimittelforschung, 49, pp. 324-329.
35. MolyneuxS.L. (2006) Development of assays for Coenzyme Q10 and their application in clinical trials. A thesis submitted in partial fulfilment of the
requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Chemistry in the University of Canterbury.
36. Morton R.A, Wilson G.M, Lowe J.S, Leat W.M.F. (1957), Ubiquinone. In: Chemical Industry, pp. 1649-1653.
37. MunkholmH, HansenH, RasmussenK. (1999) Coenzyme Q10 treatment in seriousheart failure. Biofactors 9, pp. 285–289.
38. NarendraK.S, PusphaA, SujataA.S, BhavanaB.K. (2012), Fermentation, media optimization studies for Coenzyme Q10 production by Saccharomyces cerevisiae. International research journal of pharmacy ISSN pp. 2230 – 8407
39. Negishi E.(1987), Acc. Chem. Res, 20, pp 65; Van Horn D.E, Negishi E.
(1978),Selective carbon-carbon bond formation via transition metal catalysts.
Controlled carbometalation. Reaction of acetylenes with organoalane- zirconocene dichloride complexes as a route to stereo- and regio-defined trisubstituted olefins. Journal American Chemistry Society, 100, pp. 2252-2254.
40. PapasA. M. (1999), Other antioxidants”. Antioxidant status, diet, nutrition, and health. New York: CRC Press LLC, pp. 231–48.
41. Pringsheim T, Davenport W, Mackie G, Worthington I, Aube M, Christie S.N, Gladstone J, Becker W.J.(2012), Canadian Headache Society guideline for migraine prophylaxis. Cancer Journal Neurol Science, 39(2), pp. 1-59.
42. SauchetN, LaplanteS.(2006),Coenzyme Q10 Contents in Foods and Fortification
Strategies. Journal Food CompositeAnalysis, 20, pp. 403-410.
43. ScaglioneF, BarbieriB, LundstromB, LundB (1999), Coenzyme Q10 administration increases antibody titer in hepatitis B vaccinated volunteers–A single blind placebo–controlled and randomized clinical study. Biofactors, 9,
pp. 351–357.
44. SeoM.J, KimS.O. (2010), Effect of Limited Oxygen Supply on Coenzyme Q10 Production and Its Relation to Limited Electron Transfer and Oxidative Stress in Rhizobium radiobacter T6102. Journal Microbiology Biotechnology,
20(2), pp. 346–349
45. SergeL, NathalieS, Piotr B.(2009),Lipids composition of different regions of the
human brain during aging.European Journal Lipid of Science and Technology,