1.4.1 Sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic
Với mục đích khắc phục một cách hiệu quả các yếu tố bất lợi nói trên người ta đã sử dụng chủng giống vi khuẩn thuần khiết có khả năng lên men malolactic mạnh trong quá trình sản suất rượu vang. Để sử dụng các chế phấm này một cách hiệu
quả, các nhà sản xuất khuyến cáo không nên cấy trực tiếp chế phẩm vào vang non mà trước tiên phải nhân giống bằng mơi trường có bổ xung dịch nước quả và axít malic cho vi khuẩn từ từ lấy lại hoạt tính lên men malolactic rồi sau đó mới cấy vào rượu vang non, nhờ vậy tỷ lệ sống của vi khuẩn L.oenos lúc này đạt trên 80% so với khi cấy trực tiếp chỉ đạt 20%.
Sử dụng cố định tế bào cho quá trình lên men malolactic
Lên men malolactic liên tục bằng phương pháp cố định tế bào vi khuẩn
L.casei trên gel polyacrylamit lần đầu tiên được thực hiện vào năm 1985 bởi Davis
và cộng sự. Bên cạnh đó cịn có nhiều nghiên cứu về lên men malolactic bằng cố định tế bào vi khuẩn L.oenos trong gel aginat ở 25°c trong 24 giờ. Kết quả cho thấy, trong phương pháp cố định tế bào hoạt tính lên men malolactic được duy trì lâu hơn so với lên men thông thường, ngay cả trong điều kiện mơi trường có độ axít cao và hàm lượng SO2 lớn[12].
Trong một nghiên cứu khác, tế bào vi khuẩn Lactobacillussp. 48 đã được cố định trên gel k-carrageenan khi có hoặc khơng có mặt Pentagel (bentonit tinh khiết) có tác dựng làm tăng kích thước lỗ của gel do vậy tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chuyển khối của hệ thống cố định tế bào. Trong quá trình này, trực khuẩn
Lactobacilli có hoạt tính lên men axít malic, biến đổi pH mơi trường, giảm độ chua,
tạo axít lactic tương đương với quá trình lên men malolactic truyền thống [43]. Nếu như sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic để thực hiện quá trình lên men malolactic thì thời gian lên men phụ có thể rút ngắn xuống cịn vài tháng so với vài năm khi lên men theo truyền thống. Tuy nhiên, thời gian lên men phụ để cho quá trình lên men malolactic diễn ra triệt để chỉ mất có vài ngày, thậm chí là vài giờ khi tiên hành lên men bằng cố định tế bào. Chính vì vậy, lên men malolactic bằng cố định tế bào là một giải pháp có nhiều triển vọng để nâng cao chất lượng của rượu vang.
1.4.2 Sử dụng chế phẩm enzim malolactic để chuyển hố axít malic
Cho tới nay, sử dụng chế phẩm enzim malolactic có thể được coi là một giải pháp lý tưởng nhất để chuyển hố axít malic. Đã có rất nhiều chế phẩm enzim loại này được sản suất và thương mại hoá, đặc biệt là 5 loại enzym sau: EC 1.1.1.40-
enzym malic phụ thuộc NADP, EC 1.1.1.37 - enzym malic dehydrogenaza phụ thuộc NAD, EC 1.1.1.27- enzyme phụ thuộc NAD, chuyến hố axít pyruvic thành axít lactic, EC 1.6.1.1- enzyme nicotiamit nucleotit transhydrogenaza, chuyển H từ NADPH sang NDA và enzim malolactic phụ thuộc NAD, chuyển hố trực tiếp axít malic thành axít lactic.
Hervé Vaillant và Pascal Formisyn, 1996, đã sử dụng phương pháp cố định enzim malolactic tinh sạch từ chủng L.oenos 8406 trên màng Polysulfone nhằm
chuyển hố axít malic thành axít lactic. Kết quả cho thấy nhờ có q trình tinh sạch mà hoạt lực của enzim malolactic đã tăng 7,5 lần, tức là từ 1,7 đơn vị/mg lên 12,8 đơn vị/mg protein và khối lượng của enzim này là 131 kDa. Trong điều kiện vang non có pH là 5.5 thì sau 1 tuần có tới 70% lượng axít malic có trong vang bị chuyển hố thành axít lactic và tỷ lệ này là 1:1.
1.4.3 Sử dụng chủng nấm men tái tổ hợp gen malolactat decacboxylaza trong sản xuất vang sản xuất vang
Để thực hiện quá trình lên men malolactic người ta còn đề cập tới một phương pháp hoàn toàn mới đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Đó chính là sử dụng nấm men chuyển gien. Người ta chuyển gien quyết định khả năng lên men malolactic của vi khuẩn Leuconostoc oenos vào tế bào nấm men Saccharomyces để thực hiện đồng thời quá trình lên men rượu và quá trình lên men malolactic nhằm rút ngắn qui trình sản xuất rượu vang mà vẫn thực hiệu đầy đủ các quá trình lên men. Để có thể nâng cao năng suất và chất lượng rượu vang, thỏa mãn nhu cầu tiêu thụ vang ngày càng nhiêu của thị trường.
Có thế nói xu hướng sử dụng chủng nấm men tái tổ hợp vừa có khả năng lên men rượu vừa có khả năng lên men malolactic đang thu hút được rất nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học hiện nay. Đã có rất nhiều thành cơng trong việc đưa vào các chủng nấm men rượu vang S.cerevissiae mang đoạn gen mã hoá cho enzim malolactat decacboxylaza. Bằng cách sử dụng các mồi (primer) được sinh ra từ các vùng bao thủ của các đoạn protein của enzim malic, Cécile Labarre và cộng sự, 1996 đã nhận được một đoạn ADN có kích thước 324-bp của L.oenos Lo
84.13 bằng phương pháp PCR và sử nó làm mồi để phân lập bộ genom của chủng vi khuẩn này. 2990 gen khác nhau đã đựợc xác định và 7 đoạn ADN trùng nhau đã được phân lập. Trong số chúng, một gen có kích thước 3453 bp được xác định có hai đầu đọc mở bao gồm hai đoạn chứa 1623 và 942 nucleotit tương ứng. Protein được dịch mã từ đoạn gen đầu tiên có khối lượng 59118 Da rất giống với khối lượng của enzim malolactic của vi khuẩn Lactobacillus lactỉs. Đoạn gen này sau đó đã được đưa vào vi khuẩn E.coli CBT313 và S.cerevisiae RH100 - 4. Bằng phương pháp đánh dấu người ta đã nhận thấy sự biểu hiện của gen mã hoá cho enzim malolactic nhờ vào các phân tử protein được tổng hợp có khối lượng gần bằng 60 KDa có hoạt tính enzim malolactic và khẳng định rằng hoạt tính lên men malolactic đã được biểu hiện ở cả vi khuẩn E.coli CBT313 và S.cerevisiae RH100 - 4 tái tổ
hợp. Thành công này cho phép nghĩ tới việc ứng dụng các chủng nấm men tái tổ hợp trong tương lai, khi chúng hội tụ đầy đủ các tính chất cần có của một chủng nấm men cơng nghiệp và đồng thời có hoạt tính lên men malolactic mạnh [43] .