3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn malolactic cho sản xuất rƣợu
3.1.2 Xác định khả năng lên menmalolactic của các chủng vi khuẩn phân lập
Các chủng vi khuấn lactic phân lập được đã được thí nghiệm lên men trong bình dulham nhằm xác định khả năng sinh khí và kiểu hình lên men, hoặc được thí nghiệm dưới các điều kiện có hoặc khơng có ơxy để xác định đặc tính kỵ khí hoặc hiếu khí. Kết quả của các thí nghiệm này được trình bày ở bảng 3.2
Từ bảng 3.2 cho thấy:
Trong số 20 chủng vi khuấn lactic đã được phân lập: - Có 15 chủng sinh khí và 5 chủng khơng sinh khí.
- Có 15 chủng lên men dị hình và 5 chủng lên men đồng hình.
- Có 6 chủng lên men hiếu khí, 6 chủng lên men kỵ khí tùy tiện và 8 chủng lên men kỵ khí.
- Có 12 chủng khơng có khả năng lên men malolactic và 8 chủng có khả năng lên men malolactic.
- Cả 20 chủng đều là các chủng có hoạt tính catalaza âm tính.
Từ những nhận xét trên chúng tôi chọn 8 chủng là NT3, NT6, NT8, NT9, NT10, NT12, NT14, NT19 có khả năng lên men malolactic. Chúng đều là các chủng có hoạt tính catalaza âm tính, lên men dị hình, kỵ khí hoặc kỵ khí tuỳ tiện cho nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.2 Đặc tính trao đổi chất của các chủng vi khuân lactic phân lập đƣợc Tên chủng Sinh khí Kiểu hình
lên men Kiểu hơ hấp axít malic Phân giải Hoạt tính catalaza
NT1 + Dị hình Hiếu khí - - NT2 - Đồng hình Kỵ khí tùy tiện - - NT3 + Dị hình Kỵ khí + - NT4 + Dị hình Hiếu khí - - NT5 + Dị hình Hiếu khí - - NT6 + Dị hình Kỵ khí + - NT7 - Đồng hình Kỵ khí - - NT8 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện + - NT9 + Dị hình Kỵ khí + - NT10 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện + - NT11 - Đồng hình Kỵ khí - - NT12 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện + - NT13 - Đồng hình Kỵ khí - - NT14 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện + - NT15 + Dị hình Hiếu khí - - NT16 - Đồng hình Kỵ khí - - NT17 + Dị hình Hiếu khí - - NT18 + Dị hình Hiếu khí - - NT19 + Dị hình Kỵ khí + - NT20 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện - -
Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuấn có khả năng lên men malolactic cao.
Chúng tôi lấy 8 chủng đã chọn NT3, NT6, NT8, NT9, NT10, NT12, NT14, NT19 cho nuôi cấy trong mơi trường nước nho axít (AG), nhiệt độ ni cấy là 25oC. Kết quả tuyển chọn các chủng vi khuấn có khả năng lên men malolactic cao trong mơi trường nước nho axít (AG) được trình bày ở bảng 3.3
Bảng 3.3 Khả năng lên men malolactic của 8 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc Chủng vi
khuấn
Hàm lƣợng axít malic (g/l) Hàm lƣợng axít lactic (g/l) Thời gian lên men
(ngày) Trƣớc lên men Sau lên men Trƣớc lên men Sau lên men
NT3 2,15 0,81 0,3 1,38 29 NT6 2,15 0,39 0,3 1,39 31 NT8 2,15 0,92 0,3 1,05 26 NT9 2,15 0,28 0,3 1,56 24 NT10 2,15 0,49 0,3 1,37 40 NT12 2,15 0,20 0,3 1,61 23 NT14 2,15 1,01 0,3 1,01 28 NT19 2,15 1,29 0,3 0,98 36 Ghi chú:
- Nhiệt độ quá trình lên men malolactic: 25oC
- Thời gian kết thúc lên men khi hàm lượng axít malic của dịch lên men không thay đổi đáng kể trong 3 ngày cuối cùng liên tiếp.
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy: *Khả năng phân giải axít malic
- Chủng NT19 có khả năng phân giải axít malic thấp nhất với hàm lượng axít malic cịn dư sau lên men là rất cao (1,29 g/l).
- Các chủng NT9 và NT12 có khả năng phân giải axít malic cao nhất với hàm lượng axít malic cịn dư sau lên men rất thấp.
+ Chủng NT9 hàm lượng axít malic cịn dư sau lên men là (0,28 g/l). + Chủng NT12 hàm lượng axít malic cịn dư sau lên men là (0,20 g/l). *Khả năng tạo ra Axít lactic:
- Chủng NT19 có khả năng tạo ra Axít lactic thấp nhất với hàm lượng Axít lactic được tạo ra trong dịch sau lên men là rất thấp (0,98g/l).
- Các chủng NT9 và NT12 có khả năng tạo ra Axít lactic cao nhất với hàm lượng Axít lactic được tạo ra trong dich sau lên men rất cao.
+ Chủng NT9 hàm lượng Axít lactic được tạo ra trong dịch sau lên men là (1,56 g/l). + Chủng NT12 hàm lượng Axít lactic được tạo ra trong dịch sau lên men là (1,61 g/l). *Thời gian lên men malolactic:
- Lâu nhất là chủng NT10 (40 ngày) - Chủng NT9 là (24 ngày)
- Ngắn nhất là chủng NT12 là (23 ngày)
Từ những nhận xét trên chúng tơi chọn chủng NT9 và NT12 vì có khả năng phân giải axít malic tốt nhất với hàm lượng axít malic cịn dư trong dịch lên men thấp nhất chủng NT9 là 0,28 g/l, chủng NT12 là 0,20 g/l. Chủng NT9 và NT12 cịn có khả năng lên men malolactic triệt để nhất trong thời gian ngắn từ 23 đến 24 ngày, được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.3 Xác định khả năng chịu SO2 của 2 chủng vi khuẩn malolactic phân lập được
Để đánh giá khả năng chịu SO2 và khả năng chịu etanol của các chủng malolactic phân lập được chúng tôi tiến hành lên men 2 chủng vi khuấn malolactic là NT9 và NT12 trên môi trường nước nho axít (AG) được sulphit hóa với hàm lượng K2S2O5 100 mg/l và bổ sung etanol tới nồng độ 14%v/v, nhiệt độ nuôi cấy là 25oC.
Khả năng phân giải axít malic thành axít lactic sau q trình lên men malolactic được trình bày ở bảng 3.4
Bảng 3.4 Hàm lƣợng axít malic và axít lactic trƣớc và sau lên men Malolactic trên môi trƣờng nƣớc nho axít (AG) đƣợc sulphit hóa với hàm lƣợng K2S2O5. bổ sung etanol tới nồng độ 14%v/v
Chủng vi khuẩn malolactic
Axít malic (g/l) Axít lactic (g/l) Thời gian
lên men (ngày)
Trƣớc lên men Sau lên men Trƣớc lên men Sau lên men
NT9 2,15 1,45 0,3 0,8 30
NT12 2,15 0,14 0,3 1,68 25
Ghi chú: Nhiệt độ lên men 25oC trong thời gian từ 25 đến 30 ngày.
Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy:
Khả năng phân giải axít malic
- Chủng NT9 hàm lượng axít malic cịn dư trong dịch sau lên men là (1,45 g/l). - Chủng NT12 hàm lượng axít malic cịn dư trong dịch sau lên men là (0,14 g/l).
Khả năng tạo ra Axít lactic
- Chủng NT9 hàm lượng Axít lactic được tạo thành trong dịch sau lên men là (0,8 g/l).
- Chủng NT12 hàm lượng Axít lactic được tạo thành trong dịch sau lên men là (1,68 g/l).
Thời gian lên men malolactic là
- Lâu nhất là Chủng NT9 (30 ngày) - Chủng NT12 là (25 ngày)
Từ những nhận xét trên chúng tôi nhận thấy Chủng NT9 khơng có khả năng chịu SO2 và etanol nên quá trình lên men malolactic diễn ra khơng hồn tồn. Hàm lượng axít malic cịn lại rất cao, là 1,45 g/l sau 30 ngày lên men. Còn chủng vi khuẩn cịn lại là NT12 có khả năng phân giải malic rất tốt trong điều kiện mơi trường được sulphit hóa, có nồng độ cồn cao, thể hiện ở hàm lượng malic còn lại sau lên men là không đáng kể là 0,14 g/l và có thời gian lên men nhanh là 25 ngày.
3.2 Nghiên cứu quá trình lên men malolactic của Chủng NT9 và Chủng NT12 trên môi trƣờng rƣợu vang non
Rượu vang non lên men từ dịch nho như 2.2.1 bởi chủng nấm men S. cervisiae SH09 (có thành phần etanol 12,8% v/v, đường sót 5,2 g/l, axít tổng số
5,39 g/l) được lên men malolactic bởi 2 chủng NT9, NT12 ở điều kiện nhiệt độ 25oC. Kết quả phân giải axít malic được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.1
Bảng 3.5 Hàm lƣợng axít malic trƣớc và sau q trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trƣờng rƣợu vang non
Chủng vi khuấn
Axít malic (g/l)
Trƣớc lên men Sau lên men
NT9 2,15 0,75
NT12 2,15 0,12
Hình 3.1 So sánh hàm lƣợng axít malic trƣớc và sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trƣờng rƣợu vang non
Kết quả trên bảng 3.5 và hình 3.1 cho thấy:
- Chủng NT9 hàm lượng axít malic cịn dư trong dịch sau lên men là (0,75 g/l). - Chủng NT12 hàm lượng axít malic cịn dư trong dịch sau lên men là (0,12 g/l).
Bảng 3.6 Hàm lƣợng axít lactic trƣớc và sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trƣờng rƣợu vang non
Chủng vi khuấn
Axít lactic (g/l)
Trƣớc lên men Sau lên men
NT9 0,32 0,95
NT12 0,32 1,64
Hình 3.2. So sánh hàm lƣợng axít lactic trƣớc và sau q trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trƣờng rƣợu vang non
Kết quả trên bảng 3.6 và hình 3.2 cho thấy:
Khả năng tạo ra Axít lactic
- Chủng NT9 hàm lượng Axít lactic được tạo thành trong dịch sau lên men thấp là (0,95 g/l).
- Chủng NT12 hàm lượng Axít lactic được tạo thành trong dịch sau lên men là (1,64 g/l).
Từ các nhận xét trên chúng tôi nhận thấy Chủng NT12 có khả năng phân giải axít malic tương đối tốt trên mơi trường vang non. Khả năng phân giải axít malic Chủng NT12 có khả năng phân giải nhanh và mạnh hơn so với Chủng NT9, tạo ra axit lactic có hàm lượng rất cao là 1,64 g/l.
Dịch lên men của các chủng malolactic cịn được phân tích thành phần axít
axetic kết quả được trình bày ở bảng 3.7 và hình 3.3
Bảng 3.7 Hàm lƣợng axít axetic trƣớc và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic
Chủng vi khuấn Axít axetic (g/l)
Trƣớc lên men Sau lên men
NT9 0,22 0,35
NT12 0,22 0,25
Kết quả trên bảng 3.7 và hình 3.3 cho thấy:
Khả năng tạo ra Axít axetic
- Chủng NT9 hàm lượng Axít axetic được tạo thành trong dịch sau lên men là (0,35 g/l).
- Chủng NT12 hàm lượng Axít axetic được tạo thành trong dịch sau lên men thấp nhất là (0,25 g/l).
Hình 3.3 So sánh hàm lƣợng axít axetic trƣớc và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic
Dịch lên men của các chủng malolactic cịn được phân tích thành phần diaxetyl kết quả trình bầy ở bảng 3.8 và hình 3.4
Bảng 3.8 Hàm lƣợng diaxetyl trƣớc và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic
Chủng vi khuấn Diaxetyl (g/l)
Trƣớc lên men Sau lên men
NT9 0,20 0,25
Hình 3.4 So sánh hàm lƣợng diaxetyl trƣớc và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic
Kết quả trên bảng 3.8 và hình 3.4 cho thấy:
Khả năng tạo ra Diaxetyl
- Chủng NT12 hàm lượng Diaxetyl được tạo thành trong dịch sau lên men là (0,27 g/l).
- Chủng NT9 hàm lượng Diaxetyl được tạo thành trong dịch sau lên men là (0,25 g/l).
Chủng vi khuẩn NT12 có khả năng tạo ra hàm lượng axít axetic thấp (0,25 g/l) và tạo ra diaxetyl cao (0,27 mg/l). Diaxetyl là một chất quan trọng trong quá trình lên men malolactic. Đối với vang đỏ, hàm lượng của nó từ 0,2-0,4 mg/l sẽ đóng góp tích cực vào giá trị cảm quan của rượu.
Từ những nhận xét trên, có thể rút ra kết luận là chủng vi khuẩn NT12 của có một số ưu điểm hơn Chủng NT9. Đặc biệt, khả năng tạo diaxetyl không cao của Chủng NT12 là rất phù hợp cho sản xuất các loại rượu vang đỏ khơng có mùi bơ, ngậy.
3.3 Nghiên cứu khả năng tạo chất thơm của các chủng vi khuẩn malolactic
Ngồi khả năng khử axít L-malic thành axít L-lactic, lên men malolactic cịn tác động tới sự cân bằng hương và vị của rượu vang thành phẩm do nó tạo ra nhiều chất thơm và bay hơi. Trong đó có diaxetyl là một trong những chất thơm quan trọng nhất của lên men malolactic đối với rượu vang thành phẩm. Ngay sau khi kết
thúc quá trình lên men rượu, vi khuẩn malolactic (Chủng NT9 và Chủng NT12) được cấy vào môi trường rượu vang non lên men từ dịch nho như 2.2.1 bởi chủng nấm men S.
cervisiae SH09 (có thành phần etanol 12,8% v/v, đường sót 5,2 g/l, axít tong số 5,39 g/l)
được lên men malolactic bởi 2 chủng NT9 và Chủng NT12 ở điều kiện nhiệt độ 25o C, tạo 2 mẫu thí nghiệm. Hàm lượng một số chất hay hơi tạo thành sau quá trình lên men malolactic rượu vang non của các chủng là được trình bày ở bảng 3.9
Bảng 3.9 Một số chất bay hơi tạo thành sau quá trình lên men malolactic của 02 chủng của 02 chủng Tên chủng Axít axetic (mg/L) Axít axetolactic (mg/L) Diaxetyl (mg/L) 2,3 Butanediol (mg/L) Trƣớc MLF Sau MLF Trƣớc MLF Sau MLF Trƣớc MLF Sau MLF Trƣớc MLF Sau MLF NT9 216 405 1,15 1,48 0,21 0,25 234 345 NT12 221 251 1,17 1,78 0,32 0,31 231 415
Hình 3.5 So sánh hàm lƣợng axit axetic tạo thành sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng
chủng tạo ra nhiều axít bay hơi axêtic khơng mong muốn (405mg/L), Chủng NT12 là chủng tạo ra nhiều cấc chất bay hơi mong muốn như axít axêtolactic là 1,78mg/L, diaxêlyl là 0,32mg/L và 2,3 butanediol là 415 mg/L). Theo Jan Clair Nielsen và Marianne Richelieu, 1999, trong nghiên cứu kiểm soát sự phát triển của hương thơm rượu vang trong và sau quá trình lên men malolactic bởi O.oeni đã cho thấy
hàm lượng các chất thơm của rượu vang như axít axetic là 320g/L, axít axctolactic là 1,8mg/L, diaxetyl chỉ là 0,07mg/L và 2,3 butandiol là 420mg/L [37]. Diaxetyl là một trong những chất bay hơi quan trọng nhất cua lên men malolactic. Diaxetyl tạo ra cho rượu vang mùi thơm đặc trưng của bơ hoặc lạc. Trong quá trình lên men malolactic, axít axetolactic, diaxetyl và axetoin đều là sản phẩm trung gian của sự phân huỷ axít citric thành 2,3 butandiol. Các tác giả này cũng cho thấy hàm lượng axít L-malic và citric của rượu vang sau quá trình lên men malolactic tương ứng là 0,01g/L và l0 mg/L. Trước đó, Martineau và cộng sự, 1995, đã chỉ ra rằng ngưỡng cảm nhận được mùi thơm của diaxetyl thay đổi từ 0,2mg/L trong rượu vang Chardonnay tới 0,9mg/L trong rượu vang Pinot noir và 2,8mg/L trong rượu vang Cabemet Sauvignon.
Từ các nhận xét trên chúng tôi chọn Chủng NT12 cho các nghiên cứu tiếp theo vì Chủng NT12 có 1 số đặc tính sau.
- Khả năng chịu SO2 là tốt nhất trong các chủng phân lập được: K2S2O5 100mg/l - Khả năng lên men malolactic trên môi trường rượu vang non là tốt nhất trong các chủng phân lập được.
- Khả năng tạo chất thơm tốt nhất trong trong các chủng phân lập được.
3.4 Nghiên cứu xác định các điều kiện tối ƣu quá trình lên men malolactic
O.oeni NT12
3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất dinh dưỡng bổ sung đến quá trình lên men malolactic malolactic
Tính chất của rượu vang non được trình bày trong bảng 3.10 như 2.2.1 syrô nho được pha với tỷ lệ 20%, sau đó bổ sung đường kính để đạt nồng độ chất khơ 250Bx. Lên men bằng chủng nấm men S.cerevisiae SH09. Kết thúc quá trình này
Bảng 3.10 Thành phần dịch vang non sau khi lên men rƣợu
TT Thành phần Đơn vị Hàm lƣợng
1 Etanol % v/v 12,8
2 pH 3,4
3 Axít tổng số g/l H2SO4 5,39
4 Axít bay hơi (axít axetic) g/l 0,23
5 Đường sót g/l 5,2
6 Tỷ trọng 0,981
7 SO2 tổng số g/l 35
Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy, kết thúc quá trình lên men rượu, thành phần các chất dinh dưỡng trong mơi trường rất nghèo nàn, chứng tỏ q trình lên men kiệt. Đối với vi khuẩn lactic, các yếu tố ảnh hưởng quan trọng nhất đến hiệu quả và tốc độ của quá trình lên men là pH, nồng độ etanol, nồng độ SO2 và nhiệt độ. Các yếu tố này không chỉ tác động riêng rẽ mà cịn có tác động hiệp lực. Chủng NT12 có khả năng lên men được trên môi trường rượu vang non như ở mục 2.2.1 từ chủng nấm men S. cerevisiae SH09 khơng chỉ có nồng độ ethanol và SO2 cao mà pH cịn rất thấp (3,4). Ngồi ra trong dịch rượu vang cịn rất nghèo dinh dưỡng (đường sót 5,2 g/l), hàm lượng axít tổng số cao đáng kể (5,39 g/l H2SO4). Dưới điều kiện lên men khắc nghiệt như vậy, việc bổ sung các chất dinh dưỡng vào dịch lên men giúp cho sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn lactic là rất cần thiết vì vi khuẩn lactic