2.2.1 Quy trình lên men rượu vang
Sy rơ nho được pha với tỷ lệ 20%, sau đó bổ sung đường kính để đạt nồng độ chất khơ 250 Bx. Lên men bằng chủng nấm men S.cerevisiae SH09. Kết thúc quá
trình này, tiếp tục lên men dịch trong vịng 10 ngày ở nhiệt độ 25°C, thu được rượu vang non. Bổ sung vi khuẩn malolactic (tỷ lệ giống 106
tế bào/ml) để tiến hành lên men malolactic.
Bổ sung vi khuẩn malolactic (tỷ lệ giống 106 tế bào/ml) để tiến hành lên men malolactic.
Mẫu ĐC: Lên men malolactic tự phát
Mẫu F: Lên men Malolactic, cấy vi khuẩn lactic ngay đầu quá trình lên men rượu. Mầu M: Lên men malolactic, cấy vi khuẩn lactic khi quá trình lên men rượu được 48h.
Mẫu E: Lên men malolactic, cấy vi khuẩn lactic khi quá trình lên men rượu vừa kết thúc.
2.2.2 Phương pháp vi sinh vật
- Phương pháp phân lập vi khuẩn malolactic từ nguồn nguyên liệu quả, lá nho
Hình 2.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn malolactic từ nguồn nguyên liệu quả và lá nho
- Phương pháp xác định khả năng lên men của chủng vi khuẩn malolactic
Lấy một đầu que cấy giống vi khuẩn malolactic từ khuân lạc trên đĩa petri hoặc ống thạch nghiêng rồi cấy vào 10-50 ml môi trường lên men malolactic dịch vang non sau khi lên men rượu của bộ môn thực phẩm và dinh dưỡng Viện Công nghiệp Thực phẩm cung cấp và lọc vô trùng bằng màng 0,45 micromet. Lên men ở nhiệt độ
250C. Lấy mẫu hàng ngày để kiểm tra hàm lượng axít malic bị tiêu thụ hoặc hàm lượng axít lactic tạo thành.
- Phương pháp xác định hình thái, kích thước tế bào và nảy chồi của các chủng vi khuẩn malolactic trên kính hiển vi.
- Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu đánh them phương pháp [1].
- Phương pháp xác định tế bào Gram + theo Collin, 1989 [15].
Phương pháp xác định vi khuẩn kỵ khí bằng khả năng tạo khuẩn lạc trên đĩa thạch MRS trong bình đã loại bỏ oxy [43].
- Phương pháp xác định vi khuẩn hiếu khí bằng khả năng sinh hoạt tính catalaza trên mơi trường thạch MRS [43].
- Phương pháp xác định khả năng phân giải CaCO3 của vi khuẩn malolactic: Mơi trường thạch MRS có bổ sung 20g/l CaCO3 được đổ vào các đĩa pettri.
Tiến hành đục lỗ trên các đĩa thạch với số lượng 3 lỗ/đĩa. Sau đó hút 30µl dịch vi khuẩn malolactic cho vào mỗi lỗ. Ủ các đĩa thạch ở nhiệt độ 37oC trong 3-5 ngày và quan sát vòng phân giải CaCO3 của vi khuẩn.
- Phương pháp xác định đặc tính lên men dị hình (khả năng sinh CO2) bằng ống Dulham theo Collin, 1989 [15].
Trong môi trường lên men MRS có chứa glucoza trong ống nghiệm 10ml có chứa ống Dulham ở dưới đáy của ống nghiệm được cấy giống vi khuẩn lactic. Chủng nào sinh khí CO2 sau 24 - 48h sẽ tạo ra áp xuất đẩy ống thử dulham lên phía
trên bề mặt mơi trường trong ống nghiệm. Qua đó xác định được các chủng lên men di hình. Chủng nào khơng sinh khí sẽ khơng đẩy được ống thử Dulham lên phía trên bề mặt mơi trường trong ống nghiệm.
2.2.3 Phương pháp phân tích lý hóa
- Phương pháp đo pH
30 ml mẫu được được lấy ra cho vào cốc mẫu. Giá trị pH được xác định trực tiếp bằng pH metter (Máy đo pH 315i/SET, Đức).
Độ đục của mẫu được xác định bằng máy đo độ đục Turbidity (Italy).
- Phương pháp đo tỷ trọng: Tỷ trọng của dung dịch được xác định bằng thước đo tỷ trọng ở 200C.
- Xác định axít bay hơi.
Axít bay hơi được xác định bằng phương pháp của Zoecklein và cs (1989) [48]. 10 ml mẫu được cho vào bình Sellier. Sau khi cất, 100ml dung dịch chưng cất được chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N.
Axít bay hơi được tính theo cơng thức sau đây:
Axít bay hơi (g axít axetic/l) = [ml NaOH x N x 0,06)/V] x 100 Trong đó: N: nồng độ của NaOH , V: thể tích mẫu (ml).
- Phương pháp phân tích axít tổng số.
Axít tổng số được xác định theo phương pháp của Zoecklein (1989). 10 mL mẫu được đun sôi trong 30 giây để loại bỏ C02. Sau đó 90 ml nước cất được thêm vào và sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N.
Axít tổng số được tính theo cơng thức sau:
Axít tổng số (g axít tactaric/L) =[(mL NaOH X N X 0,075)/V] X 1000 Trong đó: N: nồng độ NaOH, V: thể tích mẫu (mL).
- Phương pháp phân tích etanol
Etanol được xác định bằng phương pháp cất trên thiết bị Distiller System (Đức), sau đó xác định độ cồn bằng alcohol metter.
- Xác định hàm lượng đường tổng số bằng phương pháp Graxianop [1]. - Phương pháp xác định đường sót: theo Nelson Somogy (1952) [36]. - Phương pháp xác định hàm lượng axít L-malic:
Hàm lượng axit L-malic được đo bằng phương pháp kít chuẩn enzym (BOEHRINGER MANNHEIN, Cat.No.10139068035).
- Phương pháp xác định SO2 tự do và SO2 tổng số [20]. - Phương pháp xác định diaxetyl: theo AOAC (1995) [9].
- Phương pháp phân tích các chất thơm furfural, cis-lacton, trans-lacton và anillin: bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) [21].
- Xác định hàm lượng cồn theo TCVN 378:1986. Etanol được xác định bằng phương pháp cất trên thiết bị Distiller của Merck, sau đó xác định độ cồn bằng alcohol metter.
- Xác định hàm lượng axít L-malic, L-lactic và axít axetic bằng phương pháp kit chuẩn enzim (Boehringer Mánnhein, Đức).
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN