2.4.2.2 .Cỡ mẫu
2.6. Kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch hóa phát quang: Phát hiện định tính các kháng thể kháng lại HTLV-I và HTLV-II trong huyết thanh hoặc huyết tương người.
Hình 2.1. Hệ thống máy xét nghiệm tự động Abbott Architect I 4000 [5] 2.6.1. Nguyên lý kỹ thuật
Đây là xét nghiệm miễn dịch 2 bước nhằm mục đích phát hiện định tính kháng thể kháng lại HTLV-I và HTLV-II trong huyết thanh và huyết tương người, sử dụng cơng nghệ miễn dịch hóa phát quang (CMIA).
Hạt vi từ có gắn kháng nguyên HTLV-II và peptit tổng hợp HTLV-I/II tái tổ hợp được ủ với mẫu thử có chứa kháng thể kháng HTLV-I/II. Sau khi rửa tiếp tục bổ sung cộng hợp có chất đánh dấu Acridinium (cộng hợp có chứa kháng nguyên HTLV-I và peptit tổng hợp HTLV-I/II tái tổ hợp) sẽ tạo thành phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể-Kháng nguyên. Tiếp theo một quá trình rửa, bổ sung dung dịch tiền xúc tác (Free trigger), các Acridinium sẽ được giải phóng thành dạng tự do. Dưới tác dụng của chất xúc tác (trigger) tạo phản ứng và giải phóng ra các photon ánh sáng.
Kết quả của phản ứng hóa phát quang được tính bằng đơn vị ánh sáng tương đối (RLU). Có sự tương quan trực tiếp giữa lượng kháng thể kháng HTLV-I/II trong mẫu thử và ánh sáng đo được.
Sự có mặt hay khơng có kháng thể kháng HTLV-I/II trong mẫu được xác định bằng cách so sánh tín hiệu hóa phát quang trong phản ứng với ngưỡng phát hiện đã xác định từ đường cong hiệu chuẩn hoạt hóa. Nếu tín hiệu hóa phát quang trong phản ứng lớn hơn hoặc bằng tín hiệu ngưỡng, thì mẫu được xem như có phản ứng với kháng thể HTLV-I và hoặc kháng thể HTLV-II.
Vùng miễn dịch trội của gp21 giống nhau 100% giữa hệ gen virút HTLV-I và HTLV-II, tính tương đồng giữa 2 protein gp21 này là 86%. Ngồi ra, tính tương đồng giữa 2 peptid gp46 này là 65%, do đó các thuốc thử chọn lọc (peptid tổng hợp gp46 và kháng nguyên tái tổ hợp gp21) trong xét nghiệm này có thể đồng thời phát hiện kháng thể kháng lại HTLV-I và HTLV-II [5].
2.6.2. Các hóa chất sử dụng
- Microparticles (các vi từ): Peptid tổng hợp HTLV-I/II và kháng nguyên tái
tổ hợp HTLV-II phủ trên vi hạt trong dung dịch muối đệm TRIS. Chất bảo quản Proclin 950 và sodium azide.
- Conjugate (cộng hợp): Peptide tổng hợp HTLV-I/II và kháng nguyên tái tổ hợp HTLV-I có đánh dấu acridinium trong dung dịch đệm HEPES với chất ổn định protein và chất tẩy. Chất bảo quản Proclin 950.
- Assay Diluent (dung dịch pha loãng mẫu): rHTLV-I/II dung dịch pha loãng
xét nghiệm chứa dung dịch đệm TRIS và chất tẩy. Chất bảo quản Proclin 950 và sodium azide.
- Pre-Trigger solution (dung dịch tiền xúc tác): Dung dịch có chứa 1,32% hydrogen peroxide.
- Trigger solution (dung dịch xúc tác): Dung dịch có chứa 0,35 N sodium hydroxide.
- Wash Buffer (Dung dịch rửa): Dung dịch có chứa muối đệm phosphate. Chất bảo quản, tác nhân kháng vi sinh vật.
2.6.3. Các bước thực hiện kỹ thuật
- Bước 1: Tiến hành lấy 133 µl mẫu huyết thanh hoặc huyết tương (đã được tách từ máu toàn phần bằng cách ly tâm 10 phút ở tốc độ 3000 vịng/phút) trộn với 67µl Assay Diluent trong cóng phản ứng.
- Bước 2: Tiến hành ủ 7 phút (trong buồng ủ của máy Architect).
- Bước 3: Lấy 150 µl hỗn hợp đã pha lỗng ở trên cho vào 1 cóng phản ứng mới, sau đó bổ sung thêm 50 µl Microparticles.
- Bước 4: Tiến hành hành ủ 18 phút (trong buồng ủ của máy Architect). - Bước 5: Bổ sung 50 µl Conjugate vào cóng phản ứng.
- Bước 6: Tiếp tục ủ hỗn hợp trong cóng phản ứng thêm 4 phút (trong buồng ủ của máy Architect).
- Bước 6: Đọc kết quả, kết quả được tính bằng đơn vị ánh sáng tương đối (RLUs). Có sự tương quan trực tiếp giữa lượng kháng thể kháng HTLV-I/II trong mẫu và lượng ánh sáng đo được thông qua bộ phận quang học trong hệ thống máy Architect.
2.6.4. Cách biện luận kết quả
- Mẫu có giá trị S/CO <1,00 ở lần xét nghiệm thứ nhất được kết luận là không phản ứng với HTLV-I/II.
- Mẫu có giá trị S/CO ≥ 1,00 ở lần làm xét nghiệm đầu tiên được kết luận là phản ứng.
- Tất cả mẫu phản ứng ở lần làm xét nghiệm đầu tiên đều được thực hiện xét nghiệm lặp lại thêm 2 lần.
- Mẫu được kết luận dương tính với HTLV-I/II là những mẫu có giá trị S/CO ≥ 1 ở 2 trong 3 lần làm xét nghiệm.