Chƣơng 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường cơ bản MS. Các thí nghiệm nhân nhanh, tạo cây hồn chỉnh mẫu được ni cấy trong bình tam giác 250 ml. Tất cả các mơi trường nuôi cấy được điều chỉnh ở độ pH từ 5,8 - 6,0 trước khi được tiệt trùng và được khử trùng ở 121o
C, áp suất 1,2 atm trong thời gian 20 phút. Mẫu được nuôi cấy ở nhiệt độ 25oC; độ ẩm: ban ngày khoảng 40 - 60%, ban đêm khoảng 60 - 90%; cường độ ánh sáng từ 2000 - 3000 lux.
a. Phương pháp thu và xử lý mẫu
Nguyên liệu được chọn từ những cây to khỏe, khơng bị bệnh. Quả thì chọn những quả ở độ tuổi khơng q già, nhìn chắc (mẩy) cho nhiều hạt, vỏ quả lành lặn và khi chưa cấy nên bảo quản ở ngăn mát của tủ lạnh hoặc nơi thống mát.
Hình 2.1. Quả lồi lan Hồng thảo phi điệp tím b. Khử trùng mẫu và đưa vào ni cấy
Quy trình khử trùng mẫu đối với quả gồm các bước cơ bản sau:
Trước khi khử trùng quả được rửa sạch bằng xà phịng lỗng dưới vịi nước chảy hoặc có thể lau sạch bằng cồn 70o
C rồi đưa vào box cấy để khử trùng. Mẫu được tráng bằng cồn 70oC trong khoảng thời gian 30 giây đến 1 phút, sau đó tráng lại 3 - 5 lần bằng nước cất vô trùng.
Tiếp theo mẫu được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong khoảng thời gian từ 13 - 15 phút. Trong thời gian xử lí, quả phải được ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn và phải lắc nhẹ nhàng cho quả được ngấm đều dung dịch. Sau đó tráng lại nhiều lần bằng nước cất vơ trùng. Chuyển lên giấy thấm vô trùng để cho thấm khô hết nước và tách vỏ, rồi gieo hạt lên môi trường nuôi cấy.