Chƣơng 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Kết quả tái sinh chồi
3.2.1. Kết quả tái sinh chồi từ hạt lan Hồng thảo phi điệp tím
Các bình hạt sau 15 ngày kiểm tra nếu khơng bị nhiễm vi khuẩn, nấm thì được xem như là đảm bảo khâu vô trùng.
Hình 3.1. Hạt Hồng thảo phi điệp tím nảy mầm trên mơi trường MS chứa BAP 2,0 mg/l sau 30 ngày nuôi cấy
Sau 20 ngày có một số hạt đã trương phồng lên và phình ra sau đó chuyển từ trạng thái vàng nhạt sang vàng nâu, rồi hóa xanh và tạo thành các thể protocorm có đường kính khoảng 1mm.
Hạt lan Hồng thảo phi điệp tím sau khi khử trùng được ni cấy trên môi trường MS bổ sung NAA 0,2 mg/l và BAP với nồng độ thay đổi 1,0; 1,5 và 2,0 mg/l và pH là 5,8 đã phát sinh protocorm sau 30 ngày nuôi cấy. Và sau
2 tháng đã có hiện tượng nảy mầm, tỷ lệ nảy mầm tương đối tốt.
Bảng 3.2. Kết quả protocorm phát sinh từ hạt Hồng thảo phi điệp tím Thời gian KT (phút) NAA (mg/l) BAP (mg/l) Số bình ni cấy Protocorm phát sinh từ hạt Số bình Tỉ lệ (%) Thời gian (ngày) Mức độ 10 0,2 1,0 5 4 80,0 45 TB 0,2 1,5 6 4 66,7 40 Đạt 0,2 2,0 6 5 83,3 25 tốt 15 0,2 1,0 6 5 83,3 45 TB 0,2 1,5 12 10 83,3 35 tốt 0,2 2,0 5 5 100 25 tốt A B
Hình 3.2. Protocorm của lan Hồng thảo phi điệp tím được tạo thành từ hạt trên môi trường MS chứa BAP 2,0 mg/l
(Hình A): sau 50 ngày ni cấy; (Hình B): sau 90 ngày nuôi cấy
Từ bảng số liệu trên cho thấy mức độ phát sinh protocorm từ hạt với thời gian khử trùng 10 phút trong môi trường bổ sung NAA 0,2 mg/l và BAP 1,0 mg/l đạt 80%; môi trường bổ sung NAA 0,2 mg/l và BAP 1,5 mg/l đạt 66,7%; môi trường bổ sung NAA 0,2 mg/l và BAP 2,0 mg/l đạt 83,3%.
trong môi trường bổ sung NAA 0,2 mg/l và BAP 1,0 mg/l đạt 83,3%; môi trường bổ sung NAA 0,2 mg/l và BAP 1,5 mg/l đạt 83,3%; môi trường bổ sung NAA 0,2 mg/l và BAP 2,0 mg/l đạt 100%.
Như vậy, BAP có ảnh hưởng tới sự nảy mầm của hạt lan Hồng thảo phi điệp tím. Mức độ phát sinh protocorm trong môi trường bổ sung BAP 2,0 mg/l là cao nhất (đạt 83,3% ở thời gian khử trùng 10 phút và 100% ở thời gian khử trùng 15 phút).
Dựa vào kết quả bảng 3.2, chúng tôi cũng nhận thấy thời gian khử trùng không ảnh hưởng đến khả năng nảy mầm của hạt lan Hồng thảo phi điệp tím. Tỷ lệ nảy mầm của hạt khi khử trùng bằng HgCl2 ở thời gian 15 phút cao hơn so với thời gian 10 phút.
3.2.2. Kết quả nhân chồi từ protocorm lan Hoàng thảo phi điệp tím
Do protocorm phát sinh rất mạnh với mật độ dày đặc sau 90 ngày gieo hạt nên chúng tôi tiến hành tách cụm và cấy chuyển protocorm trong bình sang mơi trường ni cấy có thành phần tương tự. Số bình ni cấy của mỗi môi trường được lặp lại 4 lần, nguyên liệu nuôi cấy thuộc một bình mơi trường gốc ở trên. Sau 50 ngày nuôi cấy cho thấy, protocorm tiếp tục tạo thành và phát triển mạnh, hơn nữa cịn có hiện tượng tạo chồi gần như hồn tồn ở một số bình chứa mơi trường mới.
Theo dõi quá trình tạo chồi từ protocorm trong 50 ngày (Bảng 3.3) cho thấy mơi trường MS có chứa NAA 0,2 mg/l bổ sung BAP 2,0 mg/l có tỷ lệ phát sinh chồi là 97,87% cao hơn so với công thức môi trường nhân chồi MS chứa NAA 0,2 mg/l bổ sung BAP 1,0 mg/l (tỷ lệ phát sinh chồi là 50,57%) và BAP 1,5 mg/l (tỷ lệ phát sinh chồi là 78,79%).
Như vậy, chúng tôi cho rằng bổ sung BAP với nồng độ 2,0 mg/l tốt cho nhân chồi từ protocorm. Kết quả này cũng phù hợp khi so sánh với kết quả nhân chồi từ protocorm lan Kim điệp (Dendrobium Chrysotoxum) của tác giả Nguyễn
Văn Song và cộng sự. Các tác giả nhận thấy nhân chồi lan Kim điệp trên môi trường bổ sung NAA 0,1 mg/l và BAP 2,0 mg/l với nước dừa 150 ml/l là tốt nhất [6].
Bảng 3.3. Kết quả nhân chồi từ protocorm loài lan Hồng thảo phi điệp tím sau 50 ngày cấy chuyển
Mơi trƣờng nhân chồi Số lơ thí nghiệm Số cụm protocorm đƣa vào Số cụm protocorm phát sinh chồi Tỷ lệ phát sinh chồi (%) NAA (mg/l) BAP (mg/l) 0,2 1,0 1 15 10 66,7 2 17 7 41,2 3 30 15 50,0 4 25 12 48,0 Tổng 87 44 50,57 1,5 1 30 24 80,0 2 27 20 74,1 3 35 30 85,7 4 40 30 75,0 Tổng 132 104 78,79 2,0 1 25 25 100 2 20 20 100 3 26 25 96,15 4 23 22 95,7 Tổng 94 92 97,87 A B
Hình 3.3. Chồi phát sinh từ protocorm trên mơi trường MS chứa BAP 1,5 mg/l
(Hình A) và BAP 2,0 mg/l (Hình B) sau 50 ngày cấy chuyển
3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số kích thích sinh trƣởng nhóm Cytokinin đến sự nhân nhanh cụm chồi lan Hồng thảo phi điệp tím
Cytokinin có vai trị rất lớn trong việc tạo ra các cơ quan thực vật, chúng sẽ kích thích mạnh tạo ra các chồi non và hoạt động của chúng đối kháng với sự tạo rễ. Để nghiên cứu sự ảnh hưởng của cytokinin đến sự nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím, chúng tơi đã sử dụng mơi trường MS + sucrose 30 g/l + agar 6 g/l + nước dừa 100 ml/l + THT 1 g/l bổ sung BAP (nồng độ từ 0,5 mg/l đến 1,5 mg/l ) và kinetin (nồng độ từ 0,5 mg/l đến 1,5 mg/l). Thí nghiệm tiến hành trên 7 công thức, mỗi cơng thức cấy 3 bình, 5 cụm chồi/bình. Thí nghiệm 3 lần nhắc lại. Kết quả theo dõi sau 4 tuần thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nhóm Cytokinin đến sự nhân nhanh chồi lan Hồng thảo phi điệp tím
Mơi trƣờng Nồng độ BAP (mg/l) Nồng độ kinetin (mg/l) Hệ số nhân chồi Chiều cao chồi (mm) Số lá/chồi Hình thái chồi ĐC 0 0 6,72 ± 0,29 6,3 ± 0,1 1 ± 0,03 Chồi nhỏ, lá xanh nhạt CT1 0,5 0 7,25 ± 0,06 8,3 ± 0,2 1,1 ± 0,23 Chồi nhỏ, lá xanh CT2 1,0 0 8,12 ± 0,16 11,1 ± 0,16 1,67 ± 0,17 Chồi nhỏ, lá xanh đậm CT3 1,5 0 9,75 ± 0,32 11,5 ± 0,24 2,1 ± 0,23 Chồi mập, lá xanh đậm CT4 0 0,5 6,34 ± 0,16 6,4 ± 0,1 1,2 ± 0,01 Chồi nhỏ, lá xanh nhạt CT5 0 1,0 8,34 ± 0,14 9,2 ± 0,1 1,9 ± 0,13 Chồi mập, lá xanh CT6 0 1,5 7,56 ± 0,26 8,6 ± 0,02 1,6 ± 0,14 Chồi nhỏ, lá xanh nhạt
BAP (6 - benzyl amino purin) là hormone sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin có vai trị chủ yếu là kích thích sự phân chia tế bào. BAP ảnh hưởng
rõ rệt lên sự hình thành và phân hóa của cơ quan thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi. Thơng qua cơ chế di truyền BAP tác động lên quá trình sinh tổng hợp protein, từ đó ảnh hưởng đến sự tổng hợp protein, enzyme cần thiết cho sự phân chia và sinh trưởng của tế bào. Ngồi ra, BAP cịn có tác dụng ngăn chặn sự già hóa của tế bào thực vật, ngăn chặn sự phân hủy protein, axit nucleic và chlorophyll.
Kinetin là hormone sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin có cấu trúc phân tử là 6 - 2 - furfuryl - aminopurin. Tác dụng của kinetin là kích thích sự phân chia tế bào, làm chậm quá trình già hóa của tế bào. Thơng qua cơ chế di truyền kinetin tác động lên sự tổng hợp protein, từ đó ảnh hưởng đến sự tổng hợp protein, enzyme cần thiết cho sự phân chia và sinh trưởng của tế bào. Ở mức cơ thể, kinetin có ảnh hưởng thúc sự tạo chồi và tạo protocorm trên các đối tượng là thực vật [1].
Kết quả trong bảng 3.4 cho thấy ở tất cả các mơi trường đều có sự nhân chồi khi bổ sung BAP. Tuy nhiên, có sự chênh lệch lớn về hệ số nhân chồi cũng như khả năng phát triển của chồi khi thay đổi nồng độ BAP. Trong đó, mơi trường ĐC chúng tơi khơng bổ sung BAP, các mẫu thu được cho hệ số nhân chồi thấp nhất chỉ đạt 6,72. Chiều cao chồi, số lá trên chồi cũng rất kém với chiều cao trung bình chồi là 6,3 mm và số lá trên chồi là 1, chồi nhỏ, lá xanh nhạt. Khi bổ sung BAP vào môi trường, các chỉ tiêu theo dõi đã có sự thay đổi. Với nồng độ BAP 0,5 mg/l, kết quả chúng tôi ghi nhận như sau: Hệ số nhân chồi đạt 7,25; chiều cao trung bình đạt 8,3 mm và số lá/chồi là 1,1; chồi nhỏ, lá xanh. Tiếp tục tăng nồng độ của BAP lên 1 mg/l và chúng tôi thu được kết quả ở tất cả các chỉ tiêu tiếp tục tăng cao hơn hệ số nhân chồi đạt 8,12; chồi cao 11,1 mm và có 1,67 lá/chồi; các chồi phát triển xanh tốt. Chúng tôi tiếp tục tăng nồng độ BAP lên 1,5 mg/l. Qua q trình theo dõi, chúng tơi nhận thấy trên môi trường này cho hệ số nhân chồi cao nhất với hệ số nhân chồi đạt 9,75; chiều cao chồi đạt 11,5 mm và số lá là 2,1 lá/chồi, các chồi phát triển khỏe mạnh, đồng đều và có màu xanh đậm.
Kết quả cũng cho thấy mơi trường ni cấy có bổ sung kinetin ở các nồng độ khác nhau thì thu được các kết quả khác nhau. Với nồng độ kinetin 0,5 mg/l, thì hệ số nhân chồi đạt 6,34; chiều cao trung bình đạt 6,4 mm và số lá/chồi là 1,2; kinetin ở nồng độ 1,0 mg/l thì khả năng tạo chồi đạt tỷ lệ cao nhất hệ số nhân chồi đạt 8,3; chiều cao chồi đạt 9,2 mm và số lá là 1,9 lá/chồi, các chồi phát triển khỏe mạnh và có màu xanh đậm. Khi tiếp tục tăng nồng độ kinetin lên 1,5 mg/l thì khả năng tạo chồi lại giảm, hệ số nhân chồi còn 7,56; chiều cao chồi đạt 8,6 mm và số lá là 1,6 lá/chồi.
Như vậy, chúng tôi kết luận môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar 6 g/l; nước dừa 100 ml/l; THT 1 g/l và BAP 1,5 mg/l và MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar 6 g/l; nước dừa 100 ml/l; THT 1 g/l và kinetin 1,0 mg/l đều phù hợp để nhân chồi của giống lan Hồng thảo phi điệp tím. Tuy nhiên khi so sánh tác dụng của BAP và kinetin đến khả năng nhân chồi của lan Hoàng thảo phi điệp tím chúng tơi nhận thấy với công thức môi trường bổ sung BAP 1,5 mg/l thì khả năng sinh trưởng và phát triển của lan là tốt hơn so với công thức môi trường bổ sung kinetin 1,0 mg/l. Như vậy, chúng tôi kết luận rằng mơi trường thích hợp nhất cho sự nhân nhanh lan Hồng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) là môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar 6 g/l; nước dừa 100 ml/l; THT 1 g/l và BAP 1,5 mg/l.
Khi xét đến chất lượng chồi chúng tơi nhận thấy cytokinin có tác dụng quan trọng đến việc tạo chồi trong q trình ni cấy lan Hồng thảo phi điệp tím. Điển hình là với nồng độ cytokinin thấp cho kết quả tạo chồi thấp. Tuy nhiên, hiện tượng khi khơng bổ sung chất kích thích sinh trưởng cytokinin cây vẫn cho kết quả tạo chồi, có thể là do lồi lan này có chứa lượng cytokinin nội sinh cao nên vẫn tự tạo được lượng chồi tương đối dù khơng có bổ sung cytokinin vào môi trường. Đây là một trong những ưu thế của chi
Dendrobium. Do đó khi nhân giống đối tượng này ta khơng cần phải tiêu tốn
được hiện tượng đột biến cho mẫu cấy do tác dụng phụ của các chất kích thích sinh trưởng.
BAP 1,5 mg/l Kinetin 1,0 mg/l
Hình 3.4. Ảnh hưởng của BAP và kinetin tới sự nhân nhanh cụm chồi lan Hồng thảo phi điệp tím sau 60 ngày
3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của hàm lƣợng khoai tây và chuối xanh đến sự nhân nhanh lan Hồng thảo phi điệp tím (Dendrobium Anosmum Lindl.)
Ngồi các chất điều tiết sinh trưởng để thúc đẩy q trình ni cấy giúp cây sinh trưởng nhanh hơn và có chất lượng tốt hơn người ta thường bổ sung khoai tây, chuối xanh là những thành phần khơng xác định có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của mơ tế bào.
Khoai tây và chuối xanh đã được nhiều tác giả sử dụng và đạt kết quả tốt như tác giả Nguyễn Thị Sơn (2011) khi nghiên cứu nhân nhanh in vitro
giống lan Hoàng thảo long nhãn (Dendrobium fibriatum) [7]. Tác giả thu được kết quả tốt khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy một hàm lượng nhất định khoai tây và chuối xanh. Do đó trong thí nghiệm này chúng tôi đã sử dụng dịch khoai tây nghiền và chuối xanh nghiền để nghiên cứu tác dụng của chúng đối với sự sinh trưởng và phát triển của lan Hồng thảo phi điệp tím in
vitro. Các cụm lan từ thí nghiệm 1 được tách ra rồi chuyển sang mơi trường
MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar 6 g/l; nước dừa 100 ml/l; THT 1 g/l; BAP 1,5 mg/l và chuối xanh nghiền, khoai tây nghiền với hàm lượng khác nhau (Bảng 3.5). Thí nghiệm tiến hành trên 5 cơng thức, mỗi cơng thức cấy 3 bình, 3 cụm
chồi/bình và số chồi đưa vào trung bình là 5 chồi/cụm. Kết quả theo dõi sau 8 tuần nuôi cấy.
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng chuối xanh và khoai tây nghiền đến sự nhân nhanh cụm chồi lan Hồng thảo phi điệp tím sau 30 ngày
Mơi trƣờng Số chồi/cụm Chiều cao
chồi (mm) Số lá/chồi Hình thái chồi
ĐC 12,6 ± 0,06 15,1 ± 0,16 2,37 ± 0,17 Chồi mập, lá xanh
ĐC + 30 g/l
chuối xanh) 15,8 ± 0,12 18,5 ± 0,24 2,8 ± 0,02 Chồi mập, lá xanh
ĐC + 50 g/l
chuối xanh) 10,1 ± 0,01 14,8 ± 0,32 2,1 ± 0,01 Chồi nhỏ, lá xanh
ĐC + 30 g/l
khoai tây 17,6 ± 0,04 21,2 ± 0,04 2,4 ± 0,34 Chồi mập, lá xanh
ĐC + 50 g/l
khoai tây 19,2 ± 0,06 25,2 ± 2,28 3,1 ± 0,13 Chồi mập, lá xanh đậm
Kết quả bảng 3.5 cho thấy môi trường nuôi cấy bổ sung khoai tây nghiền và chuối xanh nghiền đều có ảnh hưởng khá tốt đến sự nhân nhanh và sinh trưởng lan Hồng thảo phi điệp tím. Ở mơi trường ĐC thì sự nhân lên là thấp hơn so với các môi trường khác bổ sung khoai tây nghiền và chuối xanh nghiền. Môi trường ĐC bổ sung chất KTST thì chồi cũng tiếp tục phát triển tuy nhiên các chỉ số theo dõi đều thấp. Số chồi trung bình đạt 12,6 chồi/cụm, chiều cao chồi trung bình là 15,1 mm và số lá/chồi là 2,37. Chồi nhỏ và lá xanh nhạt hơn so với chồi ở các môi trường bổ sung khoai tây nghiền và chuối xanh nghiền.
Với hàm lượng chuối xanh 30 g/l, thì số chồi trung bình đạt 15,8 chồi/cụm, chiều cao chồi trung bình là 18,5 mm và số lá/chồi là 2,8. Tuy nhiên khi tăng hàm lượng chuối xanh lên 50 g/l thì sự sinh trưởng và phát triển của chồi bị giảm, số chồi trung bình đạt 10,1 chồi/cụm, chiều cao chồi
trung bình là 14,8 mm và số lá/chồi là 2,1. Như vậy, kết quả cho thấy rằng hàm lượng chuối xanh tốt cho sự nhân nhanh của lan Hoàng thảo phi điệp tím là 30 g/l.
Bên cạnh đó, với thí nghiệm bổ sung 30 g/l khoai tây nghiền, số chồi trung bình đạt 17,6 chồi/cụm, chiều cao trung bình đạt 21,2 mm và số lá/chồi là 2,4. Khi tăng hàm lượng khoai tây lên 50g/l thì sự phát triển của chồi là cao nhất với số chồi trung bình đạt 19,2 chồi/cụm, chiều cao trung bình đạt 25,2 mm và số lá/chồi là 3,1.
Như vậy, khi so sánh sự sinh trưởng của chồi ở mơi trường có chứa dịch chuối xanh và khoai tây nghiền, chúng tôi nhận thấy khoai tây có ảnh hưởng tích cực đến sự sinh trưởng của chồi trong giai đoạn nhân nhanh hơn so với chuối xanh nghiền vì vậy nên bổ sung vào môi trường nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím khoai tây nghiền. Hàm lượng khoai tây phù hợp là 50 g/l.
Chuối xanh 30 g/l Khoai tây 50 g/l