VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1. Vật liệu thực vật

30 giống bông cỏ nhập nội và địa phƣơng đƣợc chọn lọc từ nguồn gen có sẵn của Viện nghiên cứu Bơng và PTNN Nha Hố và những giống này đƣợc thu thập từ các nƣớc Việt Nam, Ấn Độ, Liên xô cũ (bảng 2.1).

Bảng 2.1. Tên và nguồn gốc của 30 giống bông cỏ thu thập đƣợc

TT MS TĐ Tên giống Nguồn gốc TT MS TĐ Tên Giống Nguồn gốc

1 2 Cỏ Thanh Hóa Việt Nam 16 77 91-B-16 Ấn độ 2 3 Hà Sơn Bình Việt Nam 17 78 91-B-36 Ấn độ 3 5 Cỏ Phú Khánh Việt Nam 18 79 BAA (bar x arb) Ấn độ 4 6 Cỏ Nghệ An Việt Nam 19 80 BAA (bar x arb) Ấn độ 5 7 Cỏ Bắc Ái Việt Nam 20 81 BAA (bar x arb) Ấn độ 6 15 AK-235 Ấn Độ 21 82 BAA (bar x arb) Ấn độ 7 18 Lục Ngạn Việt Nam 22 83 BAA (bar x arb) Ấn độ 8 34 B2III4 Ấn Độ 23 85 BAA (bar x arb) Ấn độ 9 35 B2IV10 Ấn Độ 24 86 BAA (bar x arb) Ấn độ 10 42 Akola Ấn Độ 25 87 BAA (bar x arb) Ấn độ 11 43 Tka 283 Ấn Độ 26 92 BAA (bar x arb) Ấn độ 12 44 Tka 188 Ấn Độ 27 93 BAA (bar x arb) Ấn độ 13 46 Ava Liên Xô 28 94 BAA (bar x arb) Ấn độ 14 75 B10 Ấn Độ 29 100 Không tên Ấn độ 15 76 91-L1-2 Ấn Độ 30 101 Không tên Ấn độ * Chú thích: MSTĐ – Mã số tập đoàn

2.1.2. Các cặp mồi SSR

50 cặp mồi SSR cho cây bông, bao gồm 6 nhóm mồi khác nhau: BNL (Brookhaven National Laboratory, 2007), MUCS (Mauricio Ulloa, 2005), MUSS (Mauricio Ulloa, 2005), NAU (Nanjing Agricultural University, 2007), STV (Taliercio E, Scheffler J. 2006), TM (John Yu, 2002) (Bảng 2.2, phụ lục 1).

Bảng 2.2. Các nhóm mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu

TT Nhóm mồi Nguồn gốc Số cặp mồi

sử dụng

1 BNL Brookhaven National Laboratory, 2007 20 2 MUCS Mauricio Ulloa, 2005 6 3 MUSS Mauricio Ulloa, 2005 4 4 NAU Nanjing Agricultural University, 2007 10 5 STV Taliercio E, Scheffler J. 2006 4 6 TM John Yu, 2002 6

Tổng số 50

2.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, KỸ THUẬT SỬ DỤNG

2.2.1. Phương pháp đánh giá tính kháng bệnh xanh lùn của các giống bông cỏ

2.2.1.1. Phương pháp chuẩn bị nguồn rệp mang bệnh

Cách 1: Rệp đƣợc thu thập ở các lá cây bị bệnh xanh lùn (có triệu chứng điển hình) sau đó đƣợc truyền trực tiếp lên cây bơng thí nghiệm.

Cách 2: Thu rệp trên đồng ruộng (cây bông và các cây ký chủ) rồi truyền cho cây bơng D16-2. Sau đó lấy rệp từ cây bị bệnh truyền sang cây bơng thí nghiệm.

Quá trình chuẩn bị nguồn rệp mang bệnh đƣợc thực hiện tại Viện Nghiên cứu bông và PTNN Nha Hố.

Các giống bông cỏ đƣợc gieo trồng với ba lần nhắc lại và đƣợc bố trí theo phƣơng pháp ngẫu nhiên. Tính kháng/nhiễm của các giống bông đƣợc đánh giá bằng 2 phƣơng pháp lây nhiễm nhân tạo: (1) truyền rệp ở giai đoạn cây bông đƣợc 3 – 5 ngày tuổi, truyền rệp mang nguồn bệnh xanh lùn (15 con/cây), cho chích hút trên cây bơng 48h sau đó phun thuốc diệt rệp; (2) ghép cây, ở giai đoạn 25 – 30 ngày tuổi, nếu cây chƣa bị bệnh thì ghép với cây bị bệnh xanh lùn theo phƣơng pháp ghép áp.

Phƣơng pháp đánh giá bệnh đƣợc tiến hành dựa trên mức độ biểu hiện bệnh xanh lùn theo 4 cấp của Junior và cs. (2008), thang điểm đƣợc ghi nhận nhƣ sau:

+ Cấp 0: Khơng nhiễm bệnh

+ Cấp 1: Màu lá bình thƣờng nhƣng lá bị biến dạng nhẹ + Cấp 2: Lá có màu đậm và bị biến dạng dễ nhận thấy

+ Cấp 3: Lá có màu xanh nhạt, bị biến dạng nhiều và gân lá vàng

- Cách tính điểm kháng/nhiễm: Cây có bệnh cấp 0: đƣợc đánh giá kháng. Cây có có bệnh 1-3 đƣợc đánh giá nhiễm.

Sau khi lây bệnh nhân tạo tiến hành theo dõi các chỉ tiêu tỷ lệ bệnh và thời gian ủ bệnh. Căn cứ vào kết quả này, những cây khơng bị bệnh tiếp tục chăm sóc và chọn lọc theo đặc điểm hình thái, chất lƣợng và năng suất xơ.

Hình 2.1. Các cấp bệnh xanh lùn đánh giá trong phịng thí nghiệm

2.2.2. Phương pháp đánh giá đặc tính nơng sinh học, tiềm năng năng suất của các giống bông

Các giống bông đƣợc gieo trồng và theo dõi theo các chỉ tiêu, quy trình chung của ngành bơng:

- Diện tích ơ thí nghiệm: 6m2/1 giống. - Diện tích bảo vệ: 100m2

- Tổng diện tích thí nghiệm: 400m2.

Phƣơng pháp đánh giá đặc tính nơng sinh học, các chỉ tiêu cấu thành năng suất và chất lƣợng xơ của các giống bông trong nghiên cứu đƣợc thực hiện theo đúng Quy phạm khảo nghiệm giá trị canh tác và giá trị sử dụng của cây bông (10TCN 911: 2006).

2.2.2.1. Nhóm chỉ tiêu về sinh trưởng

a. Chiều cao cây: Theo dõi 10 cây trong số 20 cây đã chọn theo nguyên tắc

cách 1 cây đo 1 cây (trừ cây dị dạng, mất đỉnh sinh trƣởng và 2 cây đầu hàng), đo từ vết hai lá sò đến đỉnh sinh trƣởng ngọn.

Bảng 2.3. Bảng số liệu đánh giá chiều cao cây

Giống Số lần nhắc

Chiều cao cây thứ ...(cm) TB (cm) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A I II

b. Số đốt trên thân chính: Đƣợc tính từ vết hai lá sị, cứ một mắt là một đốt. c. Chiều dài đốt thân trung bình: Chiều cao cây chia cho số đốt trên thân chính ở giai đoạn tƣơng ứng.

d. Vị trí cành quả đầu tiên: Lá thật đầu tiên đƣợc gọi là vị trí 1, lá thật thứ 2

đƣợc gọi là vị trí 2 ...vị trí cành quả đầu tiên tƣơng ứng với vị trí lá thật. Cành quả đầu tiên thƣờng đâm từ nách lá thật thứ 5, 6 trở lên.

e. Số cành quả: Cành quả sinh trƣởng theo phƣơng thức mầm nách, do đó cành

có dạng gãy khúc chữ chi. Cành quả thƣờng đâm thẳng từ thân chính ra thành một góc thẳng, là loại cành trực tiếp mang nụ, hoa và quả. Cành quả đƣợc tính khi đã có nụ.

g. Chiều dài cành quả: Đo từ thân chính đến đỉnh sinh trƣởng của cành. h. Số đốt trên cành quả: Đƣợc tính từ thân chính, cứ một lá là một đốt. 2.2.2.2. Nhóm chỉ tiêu về năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất

a. Số quả/cây: Đếm số quả cây (quy định quả to bằng ngón tay cái trở lên) vào thời kỳ 50% số cây có quả đầu tiên nở.

b. Khối lượng quả: Trƣớc mỗi đợt thu hoạch thu 20-25 quả/điểm (thí nghiệm

ơ lớn) hoặc 20-25 quả/ơ (thí nghiệm ơ nhỏ) để cân khối lƣợng quả sau đó tính trung bình.

c. Năng suất lý thuyết: Sau khi có khối lƣợng quả, dựa trên mật độ cây cuối

vụ để tính năng suất lý thuyết.

NSLT = Số quả/cây x mật độ cây/m2 x khối lƣợng quả(g) x 10000m2 x 10-5 (tạ/ha).

2.2.2.3. Nhóm chỉ tiêu về hạt, tỉ lệ xơ và chất lượng xơ.

Thu tồn bộ lƣợng bơng hạt có trên cây của mỗi điểm qua các lần thu hoạch (trừ bông múi cau), trộn đều và lấy mẫu đại diện theo cách phân tƣ cho đến lúc đủ lƣợng bơng cần thiết dùng cho phân tích xơ (khoảng 100-150g).

a. Khối lượng 100 hạt: Đếm 100 hạt đem cân để biết khối lƣợng. b. Tỷ lệ xơ

Tỷ lệ xơ (%) = Khối lƣợng xơ bông / Khối lƣợng bông hạt

c. Các chỉ tiêu về chất lượng xơ: Độ bền, độ mịn, độ chín, chiều dài xơ, độ

đều xơ… đƣợc thực hiện trên máy.

- Chiều dài trung bình nửa trên (Upper Half Mean length: UHML): Chiều

dài trung bình nửa trên là chiều dài trung bình của một nửa số xơ có chiều dài dài hơn nửa cịn lại, đƣợc biểu thị bằng tiếp tuyến từ điểm 50% trên biểu đồ phân bố xơ của chùm xơ thử (hình 2.1b)

- Chiều dài trung bình (Mean Length, ML): Chiều dài trung bình là chiều dài

xơ trung bình của tất cả các xơ có trong mẫu bơng, đƣợc biểu thị bằng tiếp tuyến từ điểm 100% trên biểu đồ phân bố xơ của chùm xơ thử (hình 2.2a).

Hình 2.2. Chiều dài xơ đo bằng thiết bị HVI

(a) Chiều dài trung bình (b) Chiều dài trung bình nửa trên

- Chỉ số độ đồng đều (Uniformity Index): Chỉ số độ đồng đều là tỷ số giữa chiều

dài trung bình và chiều dài trung bình nửa trên đƣợc tính bằng đơn vị phần trăm.

- Độ bền (Strength): Độ bền xơ biểu thị sức bền của một chùm xơ đối với

một lực kéo đứt đƣợc tính bằng đơn vị gam lực/tex (G/tex). Trong đó, đơn vị tex là khối lƣợng đƣợc tính bằng gam của 1.000 mét xơ. Độ bền ở đây chính là độ bền tƣơng đối tính trên đơn vị tex thay cho việc xác định ứng suất kéo của xơ.

- Chỉ số độ chín (Maturity Index): Chỉ số độ chín là tỷ lệ giữa bề dày thành

xơ và bề ngang xơ.

- Độ ẩm xơ (Moisture content): Độ ẩm xơ là tỷ số giữa khối lƣợng nƣớc có

trong mẫu xơ và khối lƣợng khô tuyệt đối của mẫu xơ đƣợc tính bằng phần trăm. Độ ẩm thực tế là độ ẩm của mẫu xơ trong điều kiện thực tế mà mẫu xơ đƣợc lƣu giữ.

2.2.3. Phương pháp phân tích đa hình di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR

2.2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số

DNA lá bông đƣợc tách chiết và tinh sạch theo phƣơng pháp CTAB của Doyle, J.J. và cs. (1987). Bảng 2.4. Thành phần đệm chiết Hóa chất Nồng độ Thể tích 1M Tris-HCl pH8.0 100mM 100ml 5M NaCl 1.4M 280ml 0.5M Na2- EDTA pH8.0 20mM 40ml CTAB 2%(w/v) 20g PVP40 2%(w/v) 20g DIECA 0.1% 1g -mercaptoethanol

Ascorbic acid 0.1%(w/v) 1g H2O

Tổng 1000ml

Bảng 2.5. Thành phần đệm rửa I (wash buffer I)

Hóa chất Nồng độ Thể tích

Etanol 100% 76% 380ml 1M NaOAc (Sodium acetat) 0.2M 100ml

H2O 20ml

Tổng 500ml

Bảng 2.6. Thành phần đệm rửa II (Wash buffer II)

Hóa chất Nồng độ Thể tích

Etanol 100% 76% 380ml 100mM NH4OAc (Amonium acetat) 10mM 50ml

H2O 20ml

Tổng 500ml

Quy trình tách chiết ADN tổng số:

- Mẫu lá non đƣợc nghiền mịn trong nitơ lỏng trong ống eppendorf 2ml - Thêm 1ml dung dịch đệm chiết

- Ủ 650C trong 90 phút, cứ 15 phút lắc đều một lần.

- Cho 500µl chloroform:isoamyl alcohol (24:1), lắc nhẹ trong 5 phút. Sau đó ly tâm 12.000 vịng/phút trong 15 phút.

- Chuyển phần dịch phía trên sang ống eppendorf mới, cho 500µl Isopropanol để tủa ADN. Ly tâm 12.000vịng/phút để thu kết tủa.

- Rửa kết tủa bằng 500µl Wash buffer I. Sau đó ly tâm 12.000vịng/phút trong 5 phút để thu tủa.

- Tiếp tục rửa bằng 500µl Wash buffer II. Sau đó ly tâm 12.000vòng/phút trong 5 phút để thu tủa.

- Để khơ ADN sau đó cho 50µl TE

- Khử ARN bằng cách thêm 4µl RNAse/eppendorf trong tủ ấm 370C trong 3h.

Kiểm tra ADN tổng số: Chất lƣợng và nồng độ ADN tổng số đƣợc kiểm tra

trên gel agarose 0.8%. Nồng độ chính xác đƣợc đo trên máy quang phổ Nanodrop.

2.2.3.2. Kỹ thuật PCR

Phản ứng PCR đƣợc tiến hành trên máy chu kỳ nhiệt Veriti 96well Thermal cycler. Tổng dung dịch phản ứng là 15 µl bao gồm 50ng ADN tổng số, 0.15µM mồi, 0.2 mM dNTPs, 1X dịch đệm PCR, 2.5mM MgCl2 và 0.5 đơn vị Taq TaKaRa.

Điều kiện phản ứng PCR (bảng 2.7).

Bảng 2.7. Chƣơng trình chạy phản ứng PCR

Các bước Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ Tác dụng

1 95 7 phút 1 Biến tính 2 94 55 72 15 giây 30 giây 2 phút 40 Biến tính Gắn mồi Tổng hợp 3 72 7 phút 1 Tổng hợp 4 4 Bảo quản

2.2.3.3. Phương pháp điện di trên gel agarose

Theo phƣơng pháp của Khoa Genome thực vật, Trƣờng Đại học công nghệ Texas, Mỹ (2002).

Chuẩn bị gel agarose:

- Bột Agarose đƣợc hòa tan trong dung dịch đệm theo đúng tỷ lệ (đối với kiểm tra ADN tổng số, agarose đƣợc chuẩn bị với nồng độ 0,8%; đối với kiểm tra sản phẩm PCR, gel agarose đƣợc chuẩn bị với nồng độ 3,5%).

- Đun sơi dung dịch agarose bằng lị vi sóng. - Hạ nhiệt độ của gel agarose xuống khoảng 500C.

- Bổ sung Ethidium bromide (EtBr) có nồng độ là 0.5µg/ml. - Chuẩn bị khay gel và lƣợc.

- Rót hỗn hợp gel agarose EtBr vào khay gel và cắm lƣợc. Thời gian chờ gel đông là 45 - 60 phút.

- Tra mẫu ADN.

- Chuẩn bị dung dịch đệm TBE 0,5% cho vào bể chạy điện di. - Chạy điện di tại 100mA trong 4 giờ.

- Rửa gel trong H2O, đặt gel vào máy soi UV và chụp ảnh.

2.2.3.4. Phân tích số liệu đa hình di truyền

Nhƣ̃ng sớ liê ̣u thớng kê bao gồm số allen trên locus , tần số allen phổ biến nhất, số allen đô ̣c nhất , chỉ số PIC (Polymorphism Information Content ) đƣợc tính toán sử dụng phần mềm Excel, trong đó:

- Chỉ số Tần số allen phổ biến nhất đƣợc tính bằng tỷ lê ̣ % của số cá thể xuất hiê ̣n allen phổ biến nhất trên tổng số allen xuất hiê ̣n ở tƣ̀ng locus nghiên cƣ́u

- Allen cá biệt của từng chỉ thị SSR đƣợc xác định là allen xuất hiện duy nhất ở 1 giống trong toàn bô ̣ các giống bông nghiên cƣ́u.

- Đa dạng di truyền allen của các chỉ thi ̣ S SR đƣợc đánh giá thông qua hê ̣ sớ PIC (Botstein,1980) và đƣợc tính theo phƣơng trình:

Trong đó: Pij là tần số xuất hiện của alen thứ j tƣơng ứng với mồi i.

Giá trị PIC càng lớn tức là mức độ đa hình của locus do mồi i khuếch đại

càng lớn, tức là càng nhiều allen đƣợc sinh ra.

- Hệ số tƣơng đồng di truyền S: phản ánh mức độ giống nhau và khác nhau giữa các giống. Cơ sở để tính tốn hệ số này là mơ hình tốn Nei và Li (1979) nhƣ sau: 2 xy x y N S N N   Trong đó: S là hệ số tƣơng đồng

Nx, Ny: là số băng ADN của mẫu x và y

- Khoảng cách di truyền d: d = 1 - S

Sƣ̣ có mă ̣t hay vắng mă ̣t của các allen của tƣ̀ng chỉ thi ̣ SSR đƣợc ghi nhâ ̣ n cho tất cả các giớng bơng nghiên cƣ́u, trong đó 0 là khơng có băng ADN và 1 là có băng ADN ở cùng một vị trí. Sớ liê ̣u đƣợc nhập vào chƣơng trình NTSYS-pc v. 2.1 (Rohlf, 1997) để xây dƣ̣ng ma trâ ̣n tƣơng đồng di truyền . Tiếp theo, sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hê ̣ d i truyền giƣ̃a các giố ng bông nghiên cƣ́u đƣợc xây dƣ̣ng bằng phƣơng pháp phân nhóm UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical averages).

2.2.4. Các phương pháp xử lý số liệu chính trong nghiên cứu

- Phƣơng pháp phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYS pc 2.1 (Rohlf, 1997).

- Phƣơng pháp xử lý thống kê theo chƣơng trình MSTATC (Michigan State University, 1994)

- Phƣơng pháp xử lý thống kê bằng phần mềm IRRISTAT v.4.0 (IRRI, 1998)

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. THU THẬP CÁC DỊNG, GIỐNG BƠNG CỎ (G.arboreum. L) CÓ TIỀM NĂNG NĂNG SUẤT CAO, CHẤT LƢỢNG XƠ TỐT VÀ GIỐNG BÔNG KHÁNG BỆNH XANH LÙN

Kết quả đề tài đã triển khai thu thập và chọn lọc đƣợc 30 giống bông cỏ nhập nội và địa phƣơng làm vật liệu nghiên cứu đa dạng di truyền phân tử (bảng 2.1). Một số giống bơng đƣợc chọn lọc từ nguồn gen sẵn có của viện Nghiên cứu Bơng và Phát triển nông nghiệp Nha Hố. Các giống còn lại đƣợc thu thập từ hai vùng trồng bông phổ biến của Việt Nam là Bắc Trung bộ và tỉnh Bình Thuận. 30 giống bơng cỏ này đã đƣợc triển khai gieo trên đồng ruộng tại Viện Nghiên cứu Bơng và PTNN Nha Hố (hình 3.1a) và duy trì trong nhà lƣới của Viện (hình 3.1b). Mẫu lá non của từng giống bơng riêng biệt (hình 3.1c) đã đƣợc thu thập và đƣa vào phịng thí nghiệm của Bộ môn Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp để tách chiết ADN tổng số, phục vụ phân tích chỉ thị phân tử đánh giá đa dạng di truyền.

Hình 3.1. Gieo trồng ngồi đồng (a) để duy trì và trong nhà lƣới (b,c) để lấy mẫu lá.

3.2. ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG CỦA CÁC GIỐNG BƠNG CỎ (G.arboreum L.) NHẰM XÁC ĐỊNH NGUỒN GEN KHÁNG BỆNH XANH LÙN LÀM VẬT LIỆU BAN ĐẦU CHO VIỆC LAI TẠO QUẦN THỂ

30 giống bông cỏ chọn lọc và thu thập đƣợc gieo trồng với ba lần nhắc lại và đƣợc bố trí theo phƣơng pháp ngẫu nhiên để đánh giá tính kháng/nhiễm bệnh xanh lùn. Phƣơng pháp đánh giá bệnh đƣợc tiến hành dựa trên mức độ biểu hiện bệnh xanh lùn theo 4 cấp của Junior và cs. (2008). Kết quả đánh giá tính kháng rệp truyền virus xanh lùn đƣợc tổng hợp ở bảng 3.1 và hình 3.2