(a) Chiều dài trung bình (b) Chiều dài trung bình nửa trên
- Chỉ số độ đồng đều (Uniformity Index): Chỉ số độ đồng đều là tỷ số giữa chiều
dài trung bình và chiều dài trung bình nửa trên đƣợc tính bằng đơn vị phần trăm.
- Độ bền (Strength): Độ bền xơ biểu thị sức bền của một chùm xơ đối với
một lực kéo đứt đƣợc tính bằng đơn vị gam lực/tex (G/tex). Trong đó, đơn vị tex là khối lƣợng đƣợc tính bằng gam của 1.000 mét xơ. Độ bền ở đây chính là độ bền tƣơng đối tính trên đơn vị tex thay cho việc xác định ứng suất kéo của xơ.
- Chỉ số độ chín (Maturity Index): Chỉ số độ chín là tỷ lệ giữa bề dày thành
xơ và bề ngang xơ.
- Độ ẩm xơ (Moisture content): Độ ẩm xơ là tỷ số giữa khối lƣợng nƣớc có
trong mẫu xơ và khối lƣợng khô tuyệt đối của mẫu xơ đƣợc tính bằng phần trăm. Độ ẩm thực tế là độ ẩm của mẫu xơ trong điều kiện thực tế mà mẫu xơ đƣợc lƣu giữ.
2.2.3. Phương pháp phân tích đa hình di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR
2.2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
DNA lá bông đƣợc tách chiết và tinh sạch theo phƣơng pháp CTAB của Doyle, J.J. và cs. (1987). Bảng 2.4. Thành phần đệm chiết Hóa chất Nồng độ Thể tích 1M Tris-HCl pH8.0 100mM 100ml 5M NaCl 1.4M 280ml 0.5M Na2- EDTA pH8.0 20mM 40ml CTAB 2%(w/v) 20g PVP40 2%(w/v) 20g DIECA 0.1% 1g -mercaptoethanol
Ascorbic acid 0.1%(w/v) 1g H2O
Tổng 1000ml
Bảng 2.5. Thành phần đệm rửa I (wash buffer I)
Hóa chất Nồng độ Thể tích
Etanol 100% 76% 380ml 1M NaOAc (Sodium acetat) 0.2M 100ml
H2O 20ml
Tổng 500ml
Bảng 2.6. Thành phần đệm rửa II (Wash buffer II)
Hóa chất Nồng độ Thể tích
Etanol 100% 76% 380ml 100mM NH4OAc (Amonium acetat) 10mM 50ml
H2O 20ml
Tổng 500ml
Quy trình tách chiết ADN tổng số:
- Mẫu lá non đƣợc nghiền mịn trong nitơ lỏng trong ống eppendorf 2ml - Thêm 1ml dung dịch đệm chiết
- Ủ 650C trong 90 phút, cứ 15 phút lắc đều một lần.
- Cho 500µl chloroform:isoamyl alcohol (24:1), lắc nhẹ trong 5 phút. Sau đó ly tâm 12.000 vịng/phút trong 15 phút.
- Chuyển phần dịch phía trên sang ống eppendorf mới, cho 500µl Isopropanol để tủa ADN. Ly tâm 12.000vịng/phút để thu kết tủa.
- Rửa kết tủa bằng 500µl Wash buffer I. Sau đó ly tâm 12.000vịng/phút trong 5 phút để thu tủa.
- Tiếp tục rửa bằng 500µl Wash buffer II. Sau đó ly tâm 12.000vòng/phút trong 5 phút để thu tủa.
- Để khơ ADN sau đó cho 50µl TE
- Khử ARN bằng cách thêm 4µl RNAse/eppendorf trong tủ ấm 370C trong 3h.
Kiểm tra ADN tổng số: Chất lƣợng và nồng độ ADN tổng số đƣợc kiểm tra
trên gel agarose 0.8%. Nồng độ chính xác đƣợc đo trên máy quang phổ Nanodrop.
2.2.3.2. Kỹ thuật PCR
Phản ứng PCR đƣợc tiến hành trên máy chu kỳ nhiệt Veriti 96well Thermal cycler. Tổng dung dịch phản ứng là 15 µl bao gồm 50ng ADN tổng số, 0.15µM mồi, 0.2 mM dNTPs, 1X dịch đệm PCR, 2.5mM MgCl2 và 0.5 đơn vị Taq TaKaRa.
Điều kiện phản ứng PCR (bảng 2.7).
Bảng 2.7. Chƣơng trình chạy phản ứng PCR
Các bước Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ Tác dụng
1 95 7 phút 1 Biến tính 2 94 55 72 15 giây 30 giây 2 phút 40 Biến tính Gắn mồi Tổng hợp 3 72 7 phút 1 Tổng hợp 4 4 Bảo quản
2.2.3.3. Phương pháp điện di trên gel agarose
Theo phƣơng pháp của Khoa Genome thực vật, Trƣờng Đại học công nghệ Texas, Mỹ (2002).
Chuẩn bị gel agarose:
- Bột Agarose đƣợc hòa tan trong dung dịch đệm theo đúng tỷ lệ (đối với kiểm tra ADN tổng số, agarose đƣợc chuẩn bị với nồng độ 0,8%; đối với kiểm tra sản phẩm PCR, gel agarose đƣợc chuẩn bị với nồng độ 3,5%).
- Đun sơi dung dịch agarose bằng lị vi sóng. - Hạ nhiệt độ của gel agarose xuống khoảng 500C.
- Bổ sung Ethidium bromide (EtBr) có nồng độ là 0.5µg/ml. - Chuẩn bị khay gel và lƣợc.
- Rót hỗn hợp gel agarose EtBr vào khay gel và cắm lƣợc. Thời gian chờ gel đông là 45 - 60 phút.
- Tra mẫu ADN.
- Chuẩn bị dung dịch đệm TBE 0,5% cho vào bể chạy điện di. - Chạy điện di tại 100mA trong 4 giờ.
- Rửa gel trong H2O, đặt gel vào máy soi UV và chụp ảnh.
2.2.3.4. Phân tích số liệu đa hình di truyền
Nhƣ̃ng sớ liê ̣u thớng kê bao gồm số allen trên locus , tần số allen phổ biến nhất, số allen đô ̣c nhất , chỉ số PIC (Polymorphism Information Content ) đƣợc tính toán sử dụng phần mềm Excel, trong đó:
- Chỉ số Tần số allen phổ biến nhất đƣợc tính bằng tỷ lê ̣ % của số cá thể xuất hiê ̣n allen phổ biến nhất trên tổng số allen xuất hiê ̣n ở tƣ̀ng locus nghiên cƣ́u
- Allen cá biệt của từng chỉ thị SSR đƣợc xác định là allen xuất hiện duy nhất ở 1 giống trong toàn bô ̣ các giống bông nghiên cƣ́u.
- Đa dạng di truyền allen của các chỉ thi ̣ S SR đƣợc đánh giá thông qua hê ̣ sớ PIC (Botstein,1980) và đƣợc tính theo phƣơng trình:
Trong đó: Pij là tần số xuất hiện của alen thứ j tƣơng ứng với mồi i.
Giá trị PIC càng lớn tức là mức độ đa hình của locus do mồi i khuếch đại
càng lớn, tức là càng nhiều allen đƣợc sinh ra.
- Hệ số tƣơng đồng di truyền S: phản ánh mức độ giống nhau và khác nhau giữa các giống. Cơ sở để tính tốn hệ số này là mơ hình tốn Nei và Li (1979) nhƣ sau: 2 xy x y N S N N Trong đó: S là hệ số tƣơng đồng
Nx, Ny: là số băng ADN của mẫu x và y
- Khoảng cách di truyền d: d = 1 - S
Sƣ̣ có mă ̣t hay vắng mă ̣t của các allen của tƣ̀ng chỉ thi ̣ SSR đƣợc ghi nhâ ̣ n cho tất cả các giớng bơng nghiên cƣ́u, trong đó 0 là khơng có băng ADN và 1 là có băng ADN ở cùng một vị trí. Sớ liê ̣u đƣợc nhập vào chƣơng trình NTSYS-pc v. 2.1 (Rohlf, 1997) để xây dƣ̣ng ma trâ ̣n tƣơng đồng di truyền . Tiếp theo, sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hê ̣ d i truyền giƣ̃a các giố ng bông nghiên cƣ́u đƣợc xây dƣ̣ng bằng phƣơng pháp phân nhóm UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical averages).
2.2.4. Các phương pháp xử lý số liệu chính trong nghiên cứu
- Phƣơng pháp phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYS pc 2.1 (Rohlf, 1997).
- Phƣơng pháp xử lý thống kê theo chƣơng trình MSTATC (Michigan State University, 1994)
- Phƣơng pháp xử lý thống kê bằng phần mềm IRRISTAT v.4.0 (IRRI, 1998)
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. THU THẬP CÁC DỊNG, GIỐNG BƠNG CỎ (G.arboreum. L) CÓ TIỀM NĂNG NĂNG SUẤT CAO, CHẤT LƢỢNG XƠ TỐT VÀ GIỐNG BÔNG KHÁNG BỆNH XANH LÙN
Kết quả đề tài đã triển khai thu thập và chọn lọc đƣợc 30 giống bông cỏ nhập nội và địa phƣơng làm vật liệu nghiên cứu đa dạng di truyền phân tử (bảng 2.1). Một số giống bơng đƣợc chọn lọc từ nguồn gen sẵn có của viện Nghiên cứu Bơng và Phát triển nông nghiệp Nha Hố. Các giống còn lại đƣợc thu thập từ hai vùng trồng bông phổ biến của Việt Nam là Bắc Trung bộ và tỉnh Bình Thuận. 30 giống bơng cỏ này đã đƣợc triển khai gieo trên đồng ruộng tại Viện Nghiên cứu Bơng và PTNN Nha Hố (hình 3.1a) và duy trì trong nhà lƣới của Viện (hình 3.1b). Mẫu lá non của từng giống bơng riêng biệt (hình 3.1c) đã đƣợc thu thập và đƣa vào phịng thí nghiệm của Bộ môn Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp để tách chiết ADN tổng số, phục vụ phân tích chỉ thị phân tử đánh giá đa dạng di truyền.
Hình 3.1. Gieo trồng ngồi đồng (a) để duy trì và trong nhà lƣới (b,c) để lấy mẫu lá.
3.2. ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG CỦA CÁC GIỐNG BƠNG CỎ (G.arboreum L.) NHẰM XÁC ĐỊNH NGUỒN GEN KHÁNG BỆNH XANH LÙN LÀM VẬT LIỆU BAN ĐẦU CHO VIỆC LAI TẠO QUẦN THỂ
30 giống bông cỏ chọn lọc và thu thập đƣợc gieo trồng với ba lần nhắc lại và đƣợc bố trí theo phƣơng pháp ngẫu nhiên để đánh giá tính kháng/nhiễm bệnh xanh lùn. Phƣơng pháp đánh giá bệnh đƣợc tiến hành dựa trên mức độ biểu hiện bệnh xanh lùn theo 4 cấp của Junior và cs. (2008). Kết quả đánh giá tính kháng rệp truyền virus xanh lùn đƣợc tổng hợp ở bảng 3.1 và hình 3.2
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá khả năng kháng bệnh xanh lùn của các giống bông.
STT MS
TĐ Tên giống Nguồn gốc
Khả năng kháng bệnh xanh lùn
1 2 Cỏ Thanh Hóa Việt Nam Nhiễm 2 3 Cỏ Hà Sơn Bình Việt Nam Nhiễm 3 5 Cỏ Phú Khánh Việt Nam Nhiễm
4 6 Cỏ Nghệ An Việt Nam Kháng
5 7 Cỏ Bắc Ái Việt Nam Nhiễm 6 15 AK-235 Ấn Độ Nhiễm 7 18 Lục Ngạn Việt Nam Nhiễm 8 34 B2III4 Ấn Độ Nhiễm 9 35 B2IV10 Ấn Độ Nhiễm 10 42 Akola Ấn Độ Nhiễm 11 43 Tka 283 Ấn Độ Nhiễm 12 44 Tka 188 Ấn Độ Nhiễm 13 46 Ava Liên Xô Nhiễm 14 75 B10 Ấn Độ Nhiễm 15 76 91-L1-2 Ấn Độ Nhiễm 16 77 91-B-16 Ấn Độ Nhiễm 17 78 91-B-36 Ấn Độ Nhiễm 18 79 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm 19 80 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm 20 81 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm 21 82 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm 22 83 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm 23 85 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm
24 86 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm 25 87 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm 26 92 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm 27 93 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm 28 94 BAA (bar x arb) Ấn Độ Nhiễm 29 100 Không tên Ấn Độ Nhiễm 30 101 Không tên Ấn Độ Nhiễm
*Chú thích: MSTĐ - Mã số tập đồn
(a) (b)
Hình 3.2. Cây bơng nhiễm và kháng bệnh xanh lùn
(a) giống bị bệnh xanh lùn; (b) giống cỏ Nghệ An kháng bệnh
Kết quả nghiên cứu cho thấy, trong 30 giống bông cỏ đƣợc đƣa vào đánh giá bệnh, giống bông cỏ Nghệ An là giống duy nhất có biểu hiện kháng với bệnh xanh lùn, các giống cịn lại đều có biểu hiện nhiễm bệnh.
Đề tài đã tiến hành chọn dịng đối với tính kháng bệnh xanh lùn trên giống bông cỏ Nghệ An, kết quả đã chọn lọc đƣợc 6 dịng biểu hiện tính kháng bệnh, trong đó có 4 dịng kháng hồn tồn, đó là các dịng KXL-00-02, KXL-00-03, KXL- 00-04, KXL-00-05 (bảng 3.2). Những dịng bơng này đƣợc lƣu giữ làm vật liệu để lai với các dòng giống bông vải khác, tạo quần thể con lai lập bản đồ gen kháng bệnh xanh lùn.
Bảng 3.2. Kết quả chọn lọc các dòng kháng bệnh xanh lùn của bơng Nghệ An.
TT Dịng Tổng số
cây Tỷ lệ bệnh (%)
Thời gian ủ bệnh trung bình (ngày)
1 KXL-00-01 23 4,3 25,0 2 KXL-00-02 32 0 0 3 KXL-00-03 29 0 0 4 KXL-00-04 22 0 0 5 KXL-00-05 22 0 0 6 KXL-00-06 27 3,7 30,0
3.3. ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH NƠNG SINH HỌC CỦA CÁC GIỐNG BƠNG CỎ NGHIÊN CỨU.
Tập đồn vật liệu gồm 30 giống bông cỏ đƣợc tiến hành gieo trồng ngoài đồng ruộng và theo dõi các chỉ tiêu nông sinh học tại Viện Nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố, Ninh Thuận (hình 3.3).
Hình 3.3. Ruộng đánh giá các đặc tính nơng sinh học của các giống bơng
3.3.1. Thời gian sinh trưởng và các đặc điểm thực vật học của các giống bông nghiên cứu. nghiên cứu.
Thời gian sinh trƣởng của cây bơng đƣợc tính từ ngày gieo hạt đến ngày thu hoạch; thể hiện tính chín sớm hay muộn, tập trung hay khơng tập trung. Các giống chín sớm và tập trung thƣờng tránh đƣợc sự phá hại của sâu bệnh và thu đƣợc năng suất cao. Thời gian sinh trƣởng, phát triển của các giống dài ngắn khác nhau tuỳ thuộc vào đặc điểm di truyền của từng giống và tuỳ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh.
Kết quả nghiên cứu về thời gian sinh trƣởng và một số đặc điểm nông sinh học chính của các giống bơng nghiên cứu đƣợc trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Thời gian sinh trƣởng và các đặc điểm thực vật học chính của các giống bông cỏ trong nghiên cứu.
TT MS TĐ Tên giống TGST (ngày) Chiều cao cây (cm) Số cành đực/cây Số cành quả/cây Vị trí cành quả 1 (đốt) 1 2 Cỏ Thanh Hoá 102,6 75,3 0,5 23,1 3,7 2 3 Cỏ Hà Sơn Bình 96,0 107,0 1,5 22,2 4,9 3 5 Cỏ Phú Khánh 99,0 85,9 1,3 19,2 4,2 4 6 Cỏ Nghệ An 100,0 97,3 1,2 19,2 4,3 5 7 Cỏ Bắc Ái 97,0 87,9 1,1 23,6 4,5 6 15 AK-235 100,0 139,6 0,4 22,8 4,8 7 18 Cỏ Lục Ngạn 97,0 136,6 1,7 23,2 4,4 8 34 B2III4 99,0 155,4 2 25,4 5,4 9 35 B2IV10 102,0 118,2 1,4 20,6 4,6 10 42 Akola 103,0 125,6 0,4 22,6 4,6 11 43 Tka 283 104,0 134,4 1,6 24,8 4,8 12 44 Tka188 102,0 115,0 0,6 20,0 3,8 13 46 Ava 99,0 133,0 0,6 23,8 4,8 14 75 B10 107,0 168,4 0,6 23,6 5,6 15 76 91-L1-2 110,0 162,0 1,8 28,4 6,2 16 77 91-B-16 107,0 146,0 1 27,6 5,8 17 78 91-B-36 109,0 149,0 0,6 18,2 6,0 18 79 BAA(bar x arb) 107,0 146,2 2 26,6 6,2 19 80 BAA(bar x arb) 106,0 152,4 0,4 22,6 5,8 20 81 BAA(bar x arb) 115,0 141,6 1,8 19,0 5,2 21 82 BAA(bar x arb) 106,0 143,0 0,8 22,6 5,6 22 83 BAA(bar x arb) 108,0 127,4 3,4 18,6 9,0 23 85 BAA(bar x arb) 107,0 170,8 1,8 28,8 6,8 24 86 BAA(bar x arb) 99,0 181,0 2,4 24,6 6,8 25 87 BAA(bar x arb) 108,0 129,2 2,4 20,6 6,8 26 92 BAA(bar x arb) 107,0 126,4 3,6 20,4 8,2 27 93 BAA(bar x arb) 100,0 131,6 2,6 25,2 7,8 28 94 BAA(bar x arb) 100,0 153,4 1,8 25,0 7,2 29 100 Không tên 100,0 142,8 1,2 23,2 6,2 30 101 Không tên 106,0 164,0 1 25,6 5,8 Max 115,0 181,0 3,6 28,8 9,0
Min 96,0 75,3 0,4 18,2 3,7
Trung bình 103,4 134,9 1,5 23,0 5,7
CV (%) 0,890 1,490 6,070 3,890 12,130
LSD.05 1,503 3,291 0,146 1,465 1,122
* Chú thích: MSTĐ - Mã số tập đồn; TGST - Thời gian sinh trƣởng
CV - Hệ số biến động; LSD - Sự khác nhau có ý nghĩa thống kê. Kết quả nghiên cứu cho thấy các giống bông nghiên cứu đều có thời gian sinh trƣởng từ gieo đến nở quả từ ngắn đến trung bình, dao động từ 96 – 115 ngày và khơng có sự khác biệt lớn giữa các giống bông nghiên cứu. Giống bông cỏ Ấn Độ, BAA-81 (giống BAA có mã số tập đồn 81) có thời gian sinh trƣởng dài ngày nhất, 115 ngày. Hầu hết các giống bông Cỏ Việt Nam và giống từ Liên Xô đều là giống ngắn ngày, thời gian sinh trƣởng dao động từ 96 – 100 ngày; bao gồm cỏ Hà Sơn Bình (96 ngày), cỏ Phú Khánh (99 ngày), cỏ Nghệ An (100 ngày), cỏ Bắc Ái (97 ngày), cỏ Lục Ngạn (97 ngày) và cỏ Ava của Liên Xơ (99 ngày). Bên cạnh đó, các giống bơng của Ấn Độ có thời gian sinh trƣởng khá đồng đều, dao động từ 100 – 110 ngày; có 20/23 giống của Ấn Độ đƣợc xếp vào nhóm có thời sinh trƣởng trung bình này, chiếm 87% số bơng Ấn Độ trong nghiên cứu.
Chiều cao cây là một chỉ tiêu quan trọng phản ánh khả năng sinh trƣởng phát triển và tính thích ứng của cây bơng. Chiều cao cây là một chỉ tiêu hình thái có liên quan chặt chẽ các yếu tố di truyền, kỹ thuật trồng trọt và chịu tác động mạnh của điều kiện ngoại cảnh về dinh dƣỡng, hạn hán…, đồng thời cũng là chỉ tiêu để xác định mật độ của ruộng bơng. Chiều cao cây của các giống bơng thí nghiệm có sự dao động khá lớn, trong khoảng 75 – 181 cm; thấp nhất là giống cỏ Thanh Hóa của Việt Nam, 75,3 cm và cao nhất là giống của Ấn Độ (BAA-86), 181 cm. Nhìn chung, các giống cỏ Việt Nam đều thấp hơn các giống của Ấn Độ và của Liên Xô.
Số cành quả/cây, số cành đực/cây là các tính trạng có liên quan đến số quả/cây và năng suất bông. Thơng thƣờng thì số cành quả/cây càng nhiều thì số quả/cây càng lớn và năng suất cá thể càng cao. Kết quả nghiên cứu thí nghiệm cho thấy, số cành đực/cây và số cành quả/cây của các giống dao động lần lƣợt từ 0,4 – 3,6 cành và 18 – 28 cành. Các giống có số cành đực/cây ít là cỏ Thanh Hóa (0,5 cành), AK-235 (0,4 cành), Akola (0,4 cành), Tka188 (0,6 cành), Ava (0,6 cành),
B10 (0,6 cành), 91-B-36 (0,6 cành), BAA-80 (0,4 cành), BAA-82 (0,8 cành) và giống có số cành đực/cây nhiều nhất là BAA-92 (3,6 cành).
Số cành quả/cây của các giống tuy dao động từ 18-28 cành, nhƣng trung bình