Ngày nay, cùng với sự ra đời và phát triển nhanh chóng của các cơ sở dữ liệu di truyền (NCBI, EMB…) đặc biệt là ngân hàng EST thì việc phân lập và phát triển chỉ thị SSR dựa trên cơ sở trình tự sẵn có đã trở thành hƣớng đi nhanh chóng, đơn giản, ít tốn kém và ngày càng phổ biến hơn trong nghiên cứu đa dạng di truyền, lập bản đồ phân tử, phân lập gen và chọn tạo giống cây trồng nông nghiệp (lúa, ngô, đậu tƣơng…).
1.4. THÀNH TỰU TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY BÔNG VẢI BẰNG CHỈ THỊ ADN BÔNG VẢI BẰNG CHỈ THỊ ADN
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trong những năm gần đây, sự phát triển của sinh học phân tử đã đạt đƣợc nhiều thành tựu mà sự phong phú của các chỉ thị phân tử chỉ là một trong số đó. Chỉ thị phân tử đã đƣợc ứng dụng rất hiệu quả trong nghiên cứu di truyền thực vật mà phân tích đa dạng di truyền và chọn giống phân tử (MAS-Marker Assisted Selection) là hai lĩnh vực thành công nhất.
M. J. Iqbal và cs. (1996) đã sử dụng chỉ thị RAPD để đánh giá đa dạng di truyền 23 giống bông thƣơng mại, gồm: 22 giống bông luồi (G. hirsutum L.) và 1 giống bông cỏ (G. arboreum L.). Trong nghiên cứu này, tác giả đã sử dụng 50 mồi
RAPD, kết quả thu đƣợc 49 mồi cho đa hình trên tổng số 23 giống và 349 băng ADN đã đƣợc phát hiện, chiếm 89,1%. Ở hệ số tƣơng đồng di truyền 0,82, 22 giống bông nghiên cứu chia thành 7 nhóm chính. Nhóm 1 gồm 5 giống bông luồi, dao động tƣơng đồng từ 0,82-0,90. Nhóm 2 gồm 12 giống bông luồi, dao động tƣơng đồng từ 0,84-0,94. Cả 2 nhóm này có mối quan hệ di truyền khá gần so với các nhóm cịn lại, các nhóm cịn lại đều gồm 1 giống, có mức độ tƣơng đồng lần lƣợt là 0,78; 0,74; 0,69; 0,57; 0,55. Trong đó giống bơng cỏ (G. arboreum L.) có hệ số tƣơng đồng di truyền xa nhất so với các nhóm thuộc giống bơng luồi, 0,55.
Tại Trung Quốc, bông cỏ (Gossypium arboreum L.) đƣợc trồng khá rộng rãi và phổ biến, trong đó có nhiều dịng/giống mang đặc tính nơng sinh học tốt cũng nhƣ có giá trị về kinh tế cao. Diqiu Liu và cs. (2005) đã sử dụng 358 chỉ thị SSR để đánh giá và so sánh mức độ đa dạng di truyền của 39 giống bông cỏ đƣợc thu thập từ nhiều vùng khác nhau ở Trung Quốc với 1 giống bơng thuộc lồi G. herbaceum (có nguồn gốc ở miền nam châu Phi). Kết quả thu đƣợc 74 cặp mồi cho đa hình với tổng số 165 băng ADN xuất hiện. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa 40 giống bông dao động từ 0,58 đến 0,99, điều này chỉ ra rằng mức độ đa dạng di truyền các giống bơng nghiên cứu khá cao. Trong phân tích sự tƣơng quan di truyền qua sơ đồ hình cây, các giống bơng đƣợc chia thành 7 nhóm (A-G). Nhóm A gồm 4 giống bơng cỏ (G. arboreum) và 1 giống bơng thuộc lồi G. herbaceum với mức độ tƣơng đồng di truyền dao động từ 0.75-0,82. Nhóm B gồm 9 giống bông cỏ, dao động từ 0,77-0,99, cả 2 nhóm A và B chủ yếu tập trung ở vùng phía nam và đơng nam Trung Quốc. Nhóm C gồm 18 giống bơng cỏ, dao động từ 0,76-0,85, nhóm này tập trung ở hầu hết các tỉnh thuộc miền trung và thung lũng Yangtze. Nhóm D có 5 giống bơng, dao động từ 0,74-0,80 và các nhóm E, F, G, mỗi nhóm gồm 1 giống bơng đại diện cho các vùng khác nhau của Trung Quốc, có hệ số tƣơng đồng di truyền so với các nhóm khác lần lƣợt là 0,73; 0,70 và 0,66.
Trong một nghiên cứu khác về chỉ thị SSR, Candida H.C. de Magalhaes Bertini và cs. (2006), đã tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền của 53 giống bông luồi (G. hirsutum L.) thu thập từ Brazil bằng 31 cặp mồi SSR. Kết quả thu đƣợc 66 alen, trung bình 2,13 alen/locus và chỉ số PIC (polymorphism information content)
thay đổi từ 0,18-0,62, với giá trị trung bình 0,40. Hệ số tƣơng đồng di truyền dao động từ 0,00 đến 0,71. Khi biểu diễn sơ đồ hình cây về mối tƣơng quan di truyền giữa các giống, tác giả đã dựa theo vùng địa lý khí hậu khác nhau ở Brazil để chia các giống bông nghiên cứu thành 2 nhóm lớn chính A và B. Nhóm A gồm có 21 giống bông đƣợc thu thập từ vùng bán khơ hạn ở Brazil, có chu kỳ sinh trƣởng 140- 180 ngày với tỷ lệ xơ khoảng 40%, hệ số tƣơng đồng di truyền dao động từ 0,0-0,4. Nhóm B gồm có 32 giống, là các giống lai tạp đƣợc trồng ở vùng phía tây và đơng nam Brazil, những giống này có chu kỳ sinh trƣởng từ 110-140 ngày với tỷ lệ xơ khoảng 38% và hệ số tƣơng đồng di truyền của nhóm B này dao động từ 0,00-0,45. Nghiên cứu của tác giả đã cho thấy sự khác nhau khá lớn về mức độ tƣơng đồng di truyền giữa các giống bông luồi Brazil.
Một nghiên cứu khác của tác giả ngƣời Pakistan, Naveed Murtaza (2006), đã sử dụng chỉ thị AFLP (Amplified fragment length polymorphism) để đánh giá đa dạng di truyền giữa một số giống bông luồi (G. hirsutum L.) mang kiểu gen hiện đại với một giống bông cỏ (G. arboreum L.) thuộc lồi bơng thời cổ trên thế giới. Để tiến hành nghiên cứu, tác giả đã thu thập đƣợc 20 giống bông luồi (G.hirsutum L.) từ Pakistan và 1 giống bông cỏ (G. arboreum L.) từ Mỹ. Sự kết hợp của 4 cặp mồi (EcoRI-MseI) đã đƣợc sử dụng để phân tích AFLP. Kết quả số băng thu đƣợc trung bình từ 40 đến 80 băng sau khi chạy PCR với mỗi tổ hợp mồi và các băng có kích thƣớc từ 50 – 500 bp. Kết quả phân tích trên sơ đồ hình cây về hệ số tƣơng đồng di truyền đã chỉ ra 21 giống bông nghiên cứu chia thành 5 nhóm chính, trong đó bơng cỏ đƣợc tạo thành một nhóm riêng biệt, do khác nhau về mặt di truyền với 4 nhóm thuộc giống bông luồi khá lớn, hệ số tƣơng đồng của giống bơng cỏ là 0,20.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Kết quả nghiên cứu của Thái Thị Lệ Hằng (2008) khi đánh giá đa dạng di truyền 20 giống bơng luồi có nguồn gốc khác nhau sử dụng 15 cặp mồi SSR đã thu đƣợc 29 allen, với giá trị trung bình 2,0 allen/locus, độ tƣơng đồng di truyền 71% các giống bơng chia làm 2 nhóm chính: nhóm 1 chỉ gồm 1 giống bông L.36 và nhóm 2 gồm 19 giống bơng cịn lại.
Nguyễn thị Minh Nguyệt và cs. (2009) đã nghiên cứu đa dạng di truyền của 49 giống bông địa phƣơng và nhập nội, đại diện cho 3 nhóm bơng luồi (G.hirsutum
L.), bông hải đảo (G.babardense L.) và bông cỏ (G.arboreum L.). Tác giả đã sử dụng 50 cặp mồi SSR để đánh giá đa dạng di truyền. Kết quả tổng số allen thu đƣợc là 128, hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các giống bông nằm trong khoảng 0,48-0,97 trung bình là 0,8, các cặp giống xa nhau nhất về di truyền (có hệ số tƣơng đồng 0,48) chủ yếu là những cặp bông luồi-bông hải đảo. Đa dạng di truyền quan sát đƣợc trong nhóm các giống bơng luồi cao hơn so với hai nhóm bơng hải đảo và bông cỏ. Cũng trong nghiên cứu này, 49 giống bông nghiên cứu đã chia làm 3 nhóm: nhóm 1 gồm 16 giống bơng hải đảo, nhóm 2 gồm 21 giống bơng luồi, nhóm 3 gồm 12 giống bông cỏ. Hệ số tƣơng đồng di truyền của nhóm 1 với 2 nhóm bơng cịn lại thấp, chỉ khoảng 0,59. Nhóm bơng luồi và bơng cỏ gần nhau về mặt di truyền hơn, với độ tƣơng đồng di truyền khoảng 0,67. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các giống bơng trong cùng nhóm phân loại khá cao, trên 0,84.
1.5. NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN TÍNH KHÁNG BỆNH XANH LÙN
Hiện nay, cơ chế kháng bệnh xanh lùn ở bơng vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ. Có nhiều giống tỏ ra kháng bệnh đƣợc cho là do có nhiều đặc điểm khơng đƣợc rệp ƣa thích (Stephen J. Allen, 2006). Đó là các đặc điểm hình thái liên quan đến màu sắc cây, có lơng tơ, có thân cứng hoặc các đặc điểm hóa sinh nhƣ có thành phần gossypol, có lớp hóa chất bao phủ (Krisnamoorthy, 2005). Cây có màu đỏ đƣợc nhận thấy có liên quan đến tính kháng rệp (El zik & Thaxton, 1989). Những kiểu gen có biểu hiện tính kháng rệp thƣờng có hàm lƣợng protein, phenol và axit nucleic cao, lƣợng dầu và lƣu huỳnh thấp (Alimukhamedov, Shvetsova, 1988).
Những hiểu biết về kiểu di truyền tính kháng bệnh xanh lùn đóng vai trị quan trọng trong công tác lập bản đồ di truyền và sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống kháng bệnh xanh lùn ở cây bông vải.
Nghiên cứu đầu tiên về di truyền tính kháng bệnh xanh lùn đƣợc tiến hành trên giống bơng G155-7 có nguồn gốc lai 3 dịng (HAR) (Gossypium hirsutum/ G.
giống này. Nghiên cứu khơng xác định đƣợc nguồn gen kháng có từ bông cỏ châu Á
G. arboreum hay từ bông dại D. raimondii.
Cho đến gần đây, cơng trình của các tác giả Brazil (Junior & cs., 2008) đã xác định đƣợc tính kháng bệnh xanh lùn ở hai giống bơng luồi tứ bội G. hirsutum L. CD401 và Delta Opal là tính trạng đơn gen di truyền trội khi phân tích sự phân ly di truyền các cá thể của quần thể F2, BC1F1, BC1F1, F2:3 với phƣơng pháp đánh giá bệnh nhờ lây nhiễm bằng truyền bệnh qua rệp mang mầm bệnh xanh lùn. Theo nhƣ cơng bố, đây là cơng trình đầu tiên báo cáo về di truyền tính kháng bệnh xanh lùn ở cây bơng vải. Nhóm tác giả đặt tên cho gen kháng bệnh xanh lùn này là Rghv1. Tuy nhiên, nghiên cứu chƣa xác định đƣợc di truyền tính kháng bệnh xanh lùn ở hai giống bông này là do cùng một gen trội quy định hay là hai gen khác biệt. Những nghiên cứu tiếp theo để xác định các gen kháng này đang đƣợc tiến hành.
Gần đây nhất, báo cáo đầu tiên về lập bản đồ gen kháng bệnh xanh lùn ở giống bông luồi tứ bội Delta Opal của Fang và cộng sự (2009) đã đƣợc tiến hành dựa trên 364 cá thể thuộc họ F2.3 của ba quần thể đƣợc phát triển từ giống Delta Opal mà mang gen kháng trƣớc đó, sử dụng phƣơng pháp phân ly nhóm. Locus đơn gen kháng trội đƣợc định vị tại vùng telomere trên nhiễm sắc thể số 10, với 3 chỉ thị SNP đƣợc thiết kế liên kết với gen kháng ở khoảng cách từ 0.05 đến 5.4 cM. Nhóm nghiên cứu đã đặt lại tên cho locus gen kháng trội này là Cbd.
Nhóm tác giả đã sử dụng các chỉ thị liên kết với gen kháng này để khảo sát nguồn gen bông từ 25 nƣớc khác nhau. Kết quả khảo sát alen tại locus này cho thấy phần lớn các nguồn gen có nguồn gốc từ các nƣớc châu Phi, Nam Mỹ và Nam Á đều có alen kháng tại locus Cbd. Đa phần các nguồn gen bơng có nguồn gốc từ
Nam Mỹ, châu Âu, Úc và Trung Quốc đều mang alen nhiễm tại locus Cbd này. Ở nƣớc ta, những nghiên cứu đánh giá của Viện nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố cho thấy, hiện nay các giống bông luồi đang trồng phổ biến ở Việt Nam đều nhiễm bệnh xanh lùn, các giống kháng của Châu Phi, Nam Mỹ và Thái Lan khi đƣợc khảo sát ở Nha Hố cũng đều nhiễm bệnh.
Năm 2000, lần đầu tiên, trong quỹ gen cây bơng hiện có của lồi bơng cỏ Châu Á (Gossypium arboreum L.), Viện nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố đã xác định đƣợc một số đầu dịng bơng cỏ Nghệ An có khả năng kháng hồn tồn đối với
bệnh xanh lùn. Nghiên cứu đặc điểm di truyền tính kháng bệnh xanh lùn của các dịng bơng cỏ Nghệ An bƣớc đầu cho thấy tính kháng bệnh xanh lùn đƣợc quy định bởi đơn gen trội (Đặng Minh Tâm, 2006). Đây là nguồn gen kháng bệnh quý cần đƣợc đánh giá để khai thác sử dụng.
Di truyền đơn gen trội cũng đã đƣợc xác định là kiểu di truyền đối với nhiều tính trạng khác ở cây bơng vải: tính kháng bệnh nấm Colletotrichum gossypii var.
cephalosporioides (Zandona & cs., 2006); tính kháng bệnh đốm góc lá do Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (Zandona & cs., 2005), Metha & Arias
(2001) (Zandona & cs., 2005); tính kháng bệnh Stemphylium solani.
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Vật liệu thực vật
30 giống bông cỏ nhập nội và địa phƣơng đƣợc chọn lọc từ nguồn gen có sẵn của Viện nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố và những giống này đƣợc thu thập từ các nƣớc Việt Nam, Ấn Độ, Liên xô cũ (bảng 2.1).
Bảng 2.1. Tên và nguồn gốc của 30 giống bông cỏ thu thập đƣợc
TT MS TĐ Tên giống Nguồn gốc TT MS TĐ Tên Giống Nguồn gốc
1 2 Cỏ Thanh Hóa Việt Nam 16 77 91-B-16 Ấn độ 2 3 Hà Sơn Bình Việt Nam 17 78 91-B-36 Ấn độ 3 5 Cỏ Phú Khánh Việt Nam 18 79 BAA (bar x arb) Ấn độ 4 6 Cỏ Nghệ An Việt Nam 19 80 BAA (bar x arb) Ấn độ 5 7 Cỏ Bắc Ái Việt Nam 20 81 BAA (bar x arb) Ấn độ 6 15 AK-235 Ấn Độ 21 82 BAA (bar x arb) Ấn độ 7 18 Lục Ngạn Việt Nam 22 83 BAA (bar x arb) Ấn độ 8 34 B2III4 Ấn Độ 23 85 BAA (bar x arb) Ấn độ 9 35 B2IV10 Ấn Độ 24 86 BAA (bar x arb) Ấn độ 10 42 Akola Ấn Độ 25 87 BAA (bar x arb) Ấn độ 11 43 Tka 283 Ấn Độ 26 92 BAA (bar x arb) Ấn độ 12 44 Tka 188 Ấn Độ 27 93 BAA (bar x arb) Ấn độ 13 46 Ava Liên Xô 28 94 BAA (bar x arb) Ấn độ 14 75 B10 Ấn Độ 29 100 Không tên Ấn độ 15 76 91-L1-2 Ấn Độ 30 101 Không tên Ấn độ * Chú thích: MSTĐ – Mã số tập đồn
2.1.2. Các cặp mồi SSR
50 cặp mồi SSR cho cây bông, bao gồm 6 nhóm mồi khác nhau: BNL (Brookhaven National Laboratory, 2007), MUCS (Mauricio Ulloa, 2005), MUSS (Mauricio Ulloa, 2005), NAU (Nanjing Agricultural University, 2007), STV (Taliercio E, Scheffler J. 2006), TM (John Yu, 2002) (Bảng 2.2, phụ lục 1).
Bảng 2.2. Các nhóm mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu
TT Nhóm mồi Nguồn gốc Số cặp mồi
sử dụng
1 BNL Brookhaven National Laboratory, 2007 20 2 MUCS Mauricio Ulloa, 2005 6 3 MUSS Mauricio Ulloa, 2005 4 4 NAU Nanjing Agricultural University, 2007 10 5 STV Taliercio E, Scheffler J. 2006 4 6 TM John Yu, 2002 6
Tổng số 50
2.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, KỸ THUẬT SỬ DỤNG
2.2.1. Phương pháp đánh giá tính kháng bệnh xanh lùn của các giống bông cỏ
2.2.1.1. Phương pháp chuẩn bị nguồn rệp mang bệnh
Cách 1: Rệp đƣợc thu thập ở các lá cây bị bệnh xanh lùn (có triệu chứng điển hình) sau đó đƣợc truyền trực tiếp lên cây bơng thí nghiệm.
Cách 2: Thu rệp trên đồng ruộng (cây bông và các cây ký chủ) rồi truyền cho cây bơng D16-2. Sau đó lấy rệp từ cây bị bệnh truyền sang cây bơng thí nghiệm.
Q trình chuẩn bị nguồn rệp mang bệnh đƣợc thực hiện tại Viện Nghiên cứu bông và PTNN Nha Hố.
Các giống bông cỏ đƣợc gieo trồng với ba lần nhắc lại và đƣợc bố trí theo phƣơng pháp ngẫu nhiên. Tính kháng/nhiễm của các giống bông đƣợc đánh giá bằng 2 phƣơng pháp lây nhiễm nhân tạo: (1) truyền rệp ở giai đoạn cây bông đƣợc 3 – 5 ngày tuổi, truyền rệp mang nguồn bệnh xanh lùn (15 con/cây), cho chích hút trên cây bơng 48h sau đó phun thuốc diệt rệp; (2) ghép cây, ở giai đoạn 25 – 30 ngày tuổi, nếu cây chƣa bị bệnh thì ghép với cây bị bệnh xanh lùn theo phƣơng pháp ghép áp.
Phƣơng pháp đánh giá bệnh đƣợc tiến hành dựa trên mức độ biểu hiện bệnh xanh lùn theo 4 cấp của Junior và cs. (2008), thang điểm đƣợc ghi nhận nhƣ sau:
+ Cấp 0: Không nhiễm bệnh
+ Cấp 1: Màu lá bình thƣờng nhƣng lá bị biến dạng nhẹ + Cấp 2: Lá có màu đậm và bị biến dạng dễ nhận thấy
+ Cấp 3: Lá có màu xanh nhạt, bị biến dạng nhiều và gân lá vàng
- Cách tính điểm kháng/nhiễm: Cây có bệnh cấp 0: đƣợc đánh giá kháng. Cây có có bệnh 1-3 đƣợc đánh giá nhiễm.
Sau khi lây bệnh nhân tạo tiến hành theo dõi các chỉ tiêu tỷ lệ bệnh và thời gian ủ bệnh. Căn cứ vào kết quả này, những cây khơng bị bệnh tiếp tục chăm sóc và chọn lọc theo đặc điểm hình thái, chất lƣợng và năng suất xơ.
Hình 2.1. Các cấp bệnh xanh lùn đánh giá trong phịng thí nghiệm
2.2.2. Phương pháp đánh giá đặc tính nơng sinh học, tiềm năng năng suất của các giống bông