PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chƣơng 1 TỔNG QUAN

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các mẫu máu đƣợc thu thập và tách chiết lấy DNA tổng số. Sau đó, sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để nhân vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể và các đoạn chứa các chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y từ các DNA tổng số thu đƣợc. Sản phẩm PCR đƣợc thôi gel và tinh sạch để đọc trình tự trực tiếp. Kết quả đọc trình tự đƣợc xử lý, phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng. Các phƣơng pháp sử dụng đƣợc trình bày sau đây.

2.3.1. Tách chiết DNA tổng số từ máu

DNA tổng số đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp của Sambrook và Russell với một số cải tiến [63].

Mẫu máu đông lạnh đƣợc ủ ở bể ổn nhiệt 37C trong 30 phút. Chia máu vào các Eppendorf 1,5 ml với lƣợng 0,5 ml máu/Eppendorf. Tiến hành tách chiết DNA tổng số theo các bƣớc sau:

Bước 1: Bổ sung 0,5 ml đệm PBS vào các Eppendorf. Vortex nhẹ và ly tâm

6600 v/p, 15 phút ở nhiệt độ phịng. Loại bỏ dịch ở phía trên

Bước 2: Bổ sung 0,5 ml đệm phá tế bào (lysis buffer) và ủ ở 65C trong 3

Bước 3: Bổ sung 0,5 ml hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol

(25:24:1). Vortex nhẹ và ly tâm 12000 v/p, 15 phút, 4C. Thu pha trên.

Bước 4: Bổ sung 0,5 ml hỗn hợp chloroform: isoamyl alcohol (24:1). Vortex

nhẹ và ly tâm 12000 v/p, 15 phút, 4C. Hút pha trên sang Eppendorf mới.

Bước 5: Bổ sung 50 l sodium acetate 3M pH 5,2 và 1 ml EtOH 100%, ủ ở 20C trong 3 giờ.

Bước 6: Ly tâm 12000 v/p, 15 phút, 4C để thu DNA.

Bước 7: Bổ sung 0,3 ml EtOH 70% để rửa DNA. Lặp lại bƣớc này 2 lần và

làm khô DNA bằng máy hút chân không.

Bước 8: Hoà tan DNA bằng 50 l nƣớc khử ion vô trùng và bảo quản ở 20°C.

2.3.2. Nhân các đoạn DNA quan tâm bằng kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp các đoạn DNA mới từ mạch khn trong mơi trƣờng có các dNTP và cặp mồi đặc hiệu. Các đoạn DNA mới đƣợc tạo thành lại đƣợc sử dụng làm khuôn. Sau nhiều chu kỳ, đoạn DNA quan tâm đƣợc nhân lên gấp bội, nhờ vậy có thể có đủ số lƣợng phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo.

Mỗi một chu kỳ PCR gồm 3 giai đoạn sau:

- Giai đoạn biến tính: DNA mạch kép tách thành hai mạch đơn nhờ nhiệt độ

cao (94°C – 96°C ).

- Giai đoạn gắn mồi: ở nhiệt độ thích hợp, hai mồi sẽ bám vào hai đầu của

đoạn DNA đích theo nguyên tắc bổ sung.

- Giai đoạn kéo dài chuỗi: nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng đƣợc tăng lên

khoảng 70  80°C là nhiệt độ thích hợp để cho Taq DNA polymerase kéo dài chuỗi. Phản ứng PCR đƣợc thực hiện trên máy GeneAmp PCR 9700 của hang Applied Biosystems với tổng thể tích phản ứng là 25 µl gồm các thành phần sau: 50 ng DNA, đệm PCR 1X (đã bao gồm MgCl2) 700 mM mỗi dNTP, 5 Mm mồi và 1

đơn vị DreamTaq (Fermentas). Chu trình nhiệt để nhân các đoạn DNA đƣợc liệt kê dƣới đây:

- Đoạn trình tự D-loop: 96°C - 4 phút, 32 chu kỳ (94°C, 30 giây ; 58°C, 1 phút ; 72°C, 1 phút 20 giây), 72°C, 10 phút, sau đó giữ ở 4°C.

- Đoạn P186: 94°C - 4 phút, 30 chu kỳ (94°C, 30 giây ; 58°C, 45 giây ; 72°C, 45 giây), 72°C, 10 phút, sau đó giữ ở 4°C.

- Các đoạn M175, M216, P191: 94°C - 4 phút, 30 chu kỳ (94°C, 30 giây ; 56°C, 45 giây ; 72°C, 45 giây), 72°C, 10 phút, sau đó giữ ở 4°C.

- Các sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose để kiểm tra kết quả nhân các đoạn DNA. Sản phầm PCR của đoạn D-loop với kích thƣớc khoảng 1121 bp đƣợc điện di trên gel agarose 0,8 % và sản phẩm của các đoạn chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y với kích thƣớc khoảng 100bp đến 300bp đƣợc điện di trên gel agarose 2%.

- Để thu đƣợc các sản phẩm PCR đủ độ sạch để có thể tiến hành đọc trình tự, chúng tơi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng Kit GeneJET PCR Purification Kit của hãng Fermentas.

2.3.3. Phƣơng pháp xác định trình tự DNA

Trình tự của các đoạn DNA đƣợc xác định trên máy tự động ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Thành phần của PCR đọc trình tự gồm: 3,2 pM mồi, 200 ng DNA plasmid hoặc sản phẩm PCR đã đƣợc tinh sạch, BigDye, đệm tƣơng ứng trong tổng thể tích 10 l với chu trình nhiệt trên máy PCR GenAmp PCR System 9700 nhƣ sau: 96C - 1 phút; 25 chu kỳ (96C - 10 giây, 50C - 5 giây, 60C - 4 phút); giữ ở 4C.

Sản phẩm sau đó đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp tủa EtOH/EDTA: bổ sung 5 l EDTA 125 mM, 60 l EtOH 100%, để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Tiếp đó ly tâm 12000 vịng/phút trong 15 phút để thu tủa các đoạn DNA. Bổ sung 60 l EtOH 70% và ly tâm 10000 vịng/phút trong 10 phút, làm khơ tủa DNA. Bổ sung 10 l Hi-Di Formamide và biến tính ở 95C trong 5 phút. Các mẫu đƣợc chạy

trên máy xác định trình tự tự động ABI 3100 Genetic Analyzer với ống mao quản 80 cm × 50 m với polymer POP-4 của hãng ABI, Mỹ.

Số liệu từ máy giải trình tự đƣợc xử lý và phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng nhƣ Sequencing Analysis, SeqScape v2.6, BioEdit và MEGA5.1.