2.1. Ngu ên liệu
Cơ sở chọn địa điểm nghiên cứu là những khu trang trại chăn nuôi tập trung, những hộ chăn nuôi nhỏ lẻ tr n địa bàn thành phố Hà Nội.
Các địa điểm lấy mẫu gồm:
- Nƣớc thải của trại chăn nuôi lợn tại xã T n Ƣớc – Huyện Thanh Oai – Hà Nội
- Nƣớc thải ra từ các chuồng ni lợn nhỏ lẻ ra hệ thống thốt nƣớc xã Dƣơng Nội – Quận Hà Đông – Hà Nội.
- Nƣớc thải của trại nuôi vịt ở xã Trung Tú – Huyện Ứng Hòa- Hà Nội. Các mẫu sau khi đƣợc thu thập đƣợc chuyển về Phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ Enzym và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhi n và đƣợc phân tích trong thời gian 24 tiếng.
Hình 6. Các vị trí lấy mẫu (A): Trại ni vịt xã Trung Tú, (B): Cống thốt nước xã Dương Nội, (C): Trại nuôi lợn xã Tân Ước Dương Nội, (C): Trại nuôi lợn xã Tân Ước
2.2. H a chất thiết bị
2.2.1. Môi trường nuôi cấy
Môi trƣờng Winogradski 1 (g/l) - (NH4)2SO4 2g - MgSO4 0,5g - NaCl 2g - K2HPO4 1g - CaCO3 vết - FeSO4 0,4g - Nƣớc cất 1lít Mơi trƣờng Winogradski 2 (g/l). - NaNO2 1g - MgSO4 0,5g - NaCl 0.3g - K2HPO4 1g - NaCO3 1g - FeSO4 0,03g - Nƣớc cất 1lít
Mơi trƣờng (Luria – Bertani broth hay Luria broth) (g/l)
- Peptone 10g
- Cao nấm men 5g
- NaCl 10g
- Nƣớc cất 1lit
Các môi trƣờng đều đƣợc khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 120 phút. Các hóa chất khác đều đạt độ tinh sạch cho mục đ ch nghi n cứu.
2.2.2. Hóa chất
Thuốc thử Brucice sulfanil
- Brucide 1 g
- Axit sunfanyl 0,1g
- HCl 3 ml
Các hóa chất đƣợc hòa tan, làm lạnh về nhiệt độ phòng rồi định mức đến 100ml với nƣớc khử ion
Dung dịch Sunfanilamide: Hòa tan 0,6 g sunfanilamide (H2NC6H4SO2NH2) trong 50 ml nƣớc cất khử ion nóng, làm lạnh, thêm 40ml dung dịch HCl đặc và định mức đến 100ml
Dung dịch Naphtylendiamide dihydrochloride đƣợc chu n bị: Hòa tan 0,1g Naphtylendiamide dihydrochloride (C10H7NHCH2NH2.2HCl) trong 100ml nƣớc cất
khử ion.
Các dung dịch thuốc thử đều đƣợc bảo quản ở điều kiện nhiệt độ thấp và tránh ánh sáng.
2.2.3. Máy móc thiết bị
- Nồi khử trùng (ALP–Nhật).
- Máy lắc (Satorius–Đức).
- Box cấy vi sinh vật (Aura vertical– ).
- Máy đo mật độ quang học (Bionate–Anh).
- Máy đo pH (Horiba–Nhật Bản).
- Cân Kern (Satorius–Đức).
- Cân phân tích (Presica, Ý)
- Tủ ấm (Memmert–Đức).
- Máy ly t m sigma 3K30 (Sartorius–Đức).
- Tủ sấy (Memmert–Đức).
- Máy khuấy từ (IKA RET–Đức).
- K nh hiển vi điện tử qu t JSM–5421LV (Nhật).
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. hương pháp phân lập vi hu n
Từ các mẫu nƣớc thải đƣợc thu thập, sử dụng phƣơng pháp pha loãng mẫu trong nƣớc cất vô trùng để phân lập các chủng vi sinh vật. Cấy gạt dịch pha loãng ở các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 và 10-5 tr n đĩa petri chứa môi trƣờng Winogradski 1 và 2. Nuôi cấy các khu n lạc ở tủ ấm 37oC trong vòng 3 ngày đến khi xuất hiện các khu n lạc.
2.3.2. hương pháp đánh giá hả năng hình thành biofilm
Nguyên tắc: trong điều kiện dinh dƣỡng thích hợp và mơi trƣờng ni cấy
tĩnh các chủng vi sinh vật hình thành biofilm trên bề mặt giá thể. Phát hiện, quan sát biofilm bằng cách nhuộm với tím kết tinh – là chất có khả năng bắt màu với tế bào sống. Tiến hành thí nghiệm theo phƣơng pháp của Morikawa và cộng sự [57]. Các chủng vi khu n đƣợc lắc kích hoạt trong bình tam giác chứa mơi trƣờng LB trong 24 giờ ở 37oC sao cho mật độ tế bào OD620 ở vào khoảng 0,2-0,3. Hút 100 µl dịch ni cấy vi khu n bổ sung vào 700µl LB lỏng trong các ống effendorf đã khử trùng và ủ trong điều kiện tĩnh ở 37oC.
Sau 24 giờ các dịch nuôi cấy đƣợc loại bỏ khỏi các ống effendorf. Đánh giá mật độ tế bào sống trôi nổi trong môi trƣờng bằng phƣơng pháp đo OD620 dịch nuôi cấy vi khu n.
Quan sát khả năng h nh thành biofilm: Mỗi ống effendorf đƣợc rửa sạch 2 lần bằng nƣớc cất khử trùng. Bổ sung vào mỗi ống effendorf 1 ml dung dịch tím kết tinh 1% và giữ trong 25 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dung dịch nhuộm và quan sát sự bắt màu của các tế bào bám trên trên thành ống với tím kết tinh.
Đánh giá mật độ tế bào trong biofilm: Sau khi rửa sạch 2 lần bằng
nƣớc cất khử trùng các tinh thể tím bám trên thành effendorf đƣơc hòa tan trong 1ml etanol 70o. Mật độ tế bào trong biofilm đƣợc xác định bằng cách đo độ hấp thụ OD570.
2.3.3. hương pháp ch p ảnh trên nh hiển vi điện tử qu t
- Chu n bị mẫu biofilm nổi: bổ sung dịch nuôi cấy lắc vi khu n vào bình tam giác chứa 20ml môi trƣờng LB. Nuôi cấy tĩnh 24 giờ ở 37oC.
- Gắn mẫu biofilm l n lamen, hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để cố định mẫu.
- Rửa nhẹ bằng nƣớc cất khử trùng.
- Gắn mẫu l n đế. Mạ phủ mẫu bằng vàng tr n máy JFC–1200 trong 5 phút ở 30mA.
- Soi và chụp ảnh tr n k nh hiển vi qu t điện tử JSM–5421LV (Nhật) tại phòng chụp hiển vi điện tử quét – Trung Tâm Khoa Học Vật Liệu – Khoa Vật Lý – Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên.
2.3.4. hương pháp đánh giá các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành biofilm
Mỗi chủng vi khu n đều h nh thành biofilm tốt nhất ở những điều kiện th ch hợp về nhiệt độ, pH.
2.3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Đánh giá khả năng h nh thành biofilm của các chủng vi khu n trong môi trƣờng LB lỏng, nuôi cấy ở các nhiệt độ: 25oC đến 55oC. Sau 1 ngày nuôi cấy, tiến hành quan sát, đánh giá khả năng tạo biofilm của chủng vi khu n nghi n cứu.
2.3.4.2. Ảnh hưởng của pH
Đánh giá khả năng h nh thành biofilm của các chủng vi khu n trong môi trƣờng LB lỏng, nuôi cấy ở các pH khác nhau từ pH 4 đến pH 9. Sau 1 ngày nuôi cấy, tiến hành quan sát, đánh giá khả năng tạo biofilm của chủng vi khu n nghi n cứu.
2.3.4.3. Phương pháp nhuộm Gram
Ngu ên tắc: Dựa vào sự khác biệt giữa thành tế bào vi khu n Gram ( ) và
Gram (-).
Vi khu n Gram ( ) có peptidoglican hoạt động nhƣ một hàng rào th m thấu ngăn cản sự thất thoát của t m kết tinh. Ban đầu vi khu n đƣợc nhuộm bằng t m kết tinh sau đó đƣợc xử lý bằng lugol để tăng độ giữ màu. Sau đó đƣợc t y màu bằng cồn làm co các lỗ của lớp peptidoglican dày lại. Do vậy, phức chất t m kết tinh và iot đƣợc giữ lại, vi khu n có màu t m.
Peptidoglican ở vi khu n Gram (-) rất mỏng, t li n kết ch o và có lỗ lớn. Khi xử lý bằng cồn có thể loại lipit khỏi thành Gram (-) đủ để làm tăng hơn k ch thƣớc của lỗ. Do vậy, ở bƣớc rửa bằng cồn đã loại bỏ phức chất màu t m của t m kết tinh - iôt. Khi nhuộm lại bằng safranin th vi khu n có màu hồng.
2.3.5. hương pháp đánh giá hả năng chuyển hóa các hợp chất nitơ
Các chủng có hoạt t nh tạo biofilm mạnh đƣợc tiếp tục nghi n cứu về khả năng chuyển hóa nitơ.
Mỗi chủng đƣợc nuôi lắc ở 37oC trong các khoảng thời gian tối đa là 20 ngày. Môi trƣờng nuôi lắc là mơi trƣờng Winogradski 1 và 2 lỏng có bổ sung 1% pepton.
2.3.5.1. Phương pháp thử khả năng chuyển h a amoni [19]
Để đánh giá khả năng chuyển hóa amoni của các chủng vi khu n, chúng tơi ph n t ch độ giảm nồng độ amoni trong môi trƣờng nuôi vi khu n theo thời gian bằng phƣơng pháp dƣới đ y.
Nguy n tắc:
Phản ứng của amoni và hypochloride với sự có mặt của xúc tác phenol tạo thành hợp chất indophenol blue. So màu ở bƣớc sóng 640nm.
Thuốc thử:
- Hypochloride: 15g NaOH khan 500ml NaClO 0,1% sau đó định mức đến 1000ml bằng nƣớc khử ion.
- Dung dịch phenol-sodium nitroprusside (C6H5OH- Na2[Fe(CN)5.NO].2H2O): 5g phenol 0,025g nitroprusside, định mức đến 500ml bằng nƣớc khử ion.
Dung dịch chu n: Dung dịch chu n đƣợc lấy từ NH4Cl tinh khiết sấy ở 105oC trong 3 giờ, để nguội trong b nh hút m. C n 3,819g NH4Cl, hòa tan và định mức đến 1000ml bằng nƣớc khử ion. Dung dịch có nồng độ N- NH4+ là 1g/l.
Chu n bị dd có nồng độ 1mg/l bằng cách pha lỗng dd gốc.
Lập đƣờng chu n: tƣơng ứng với các nồng độ 0; 0,2; 0,4; 0,8; 1mg/l.
- Lấy 5ml mẫu vào ống thủy tinh.
- Th m 3ml thuốc thử phenol - sodium nitroprusside.
- Lắc tr n máy rung 30 gi y.
- Thêm 3ml hypochloride.
- Lắc tr n máy rung 30 giây.
- Điều nhiệt ở 37o
C trong 25 phút.
- Đo ở bƣớc sóng 640nm.
Với mẫu đo cũng làm các bƣớc tƣơng tự nhƣ lập đƣờng chu n [19].
2.3.5.2. Phương pháp thử khả năng chuyển h a nitrit[19]
Để đánh giá khả năng chuyển hóa nitrit thành nitrat, chúng tơi tiến hành đồng thời hai th nghiệm: đánh giá độ giảm nồng độ nitrit và độ tăng hàm lƣợng nitrat trong môi trƣờng nuôi cấy vi khu n theo thời gian bằng các phƣơng pháp sau.
Phƣơng pháp phân tích NO2-
.
Nguy n tắc:
Phản ứng giữa nitrit và hỗn hợp sulfanilamide với naphtylendiamine tạo phức màu hồng ở pH 2. So màu ở bƣớc sóng 540nm.
Chu n bị thuốc thử:
- Dung dịch sunfanylamide: c n 0,6g sunfanylamide hịa tan trong 50ml nƣớc cất nóng, làm lạnh, th m 40ml HCl đặc và định mức đến 100ml.
- Dung dịch naphtylendiamine dihydrochloride: cân 0,1g naphtylendiamine dihydrochloride hòa tan trong 100ml nƣớc cất, đựng trong chai màu n u, bảo quản 4oC.
Lập đƣờng chu n:
- Hòa tan 1,23g NaNO2 trong 1000ml nƣớc cất. Dung dịch gốc có nồng độ N- NO2 là 250mg/l.
- Chu n bị dd chu n có nồng độ 1mg/l bằng cách pha lỗng dd gốc.
- Lập các nồng độ khác nhau từ 0; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1mg/l.
- Lấy 10ml mỗi nồng độ vào các ống nghiệm khác nhau.
- Thêm 0,2ml sunfanylamide.
- Trộn đều và giữ y n trong 5 phút.
- Thêm 0,2ml naphtylendiamine dihydrochloride.
- Trộn đều và giữ y n trong 10 phút.
- So ở bƣớc sóng 540nm.
Với các dung dịch mẫu làm tƣơng tự nhƣ lập đƣờng chu n [19].
Phƣơng pháp phân tích NO3-
Nguy n tắc: Phản ứng giữa nitrat và Brucide ở pH 2-3 tạo thành dung dịch có màu vàng, đo ở bƣớc sóng 415nm.
Chu n bị thuốc thử: Hòa tan 1g Brucide và 0,1g axit sulfanilic và 3ml HCl vào 70ml nƣớc cất nóng, làm lạnh tới nhiệt độ phịng sau đó định mức tới 100ml.
Lập đƣờng chu n:
- Chu n bị dung dịch gốc có nồng độ N-NO3- 1g/l bằng cách hòa tan 6,071g NaNO3 đã sấy khô ở 1050C trong 3 giờ trong 100ml nƣớc khử ion, định mức đến 1000ml.
- Chu n bị dung dịch chu n có nồng độ N-NO3-
- 1mg/l bằng cách pha loãng dung dịch gốc.
- Dụng đƣờng chu n bởi các điểm ở các nồng độ 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1mg/l.
- Lấy 5ml mỗi dung dịch có nồng độ khác nhau vào các ống khác nhau.
- Th m 1ml dd NaCl 30% , lắc tr n máy rung 5giây.
- Thêm 5ml H2SO4 80%.
- Làm lạnh dƣới vòi nƣớc, lắc 30 gi y.
- Th m 0,2 ml brucide sulfanil, lắc 30 gi y.
- Đun sôi.
- Làm lạnh tới nhệt độ phịng rồi đo ở bƣớc sóng 415nm [19].
2.3.6. hương pháp phân loại dựa trên phân t ch gen 16S rRNA
Phƣơng pháp này dựa tr n phƣơng pháp Sanger có cải tiến: Dựa vào tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA – polymerase. Với việc sử dụng them các dNTP cùng các dNTP thông thƣờng, kết quả là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có k ch thƣớc khác nhau.
Vectơ tái tổ hợp có chứa đoạn gen 16S rRNA mang hai trình tự chuyên biệt, mỗi trình tự nằm trên một mạch. Khi cần xác định trình tự của mạch nào, trƣớc hết phải biến tính tách rời 2 mạch rồi sử dụng mồi bắt cặp với trình tự chuyên biệt nằm trên mạch đó.
Mỗi dideoxynucleotit đƣợc đánh dấu bằng một hóa chất huỳnh quang có màu khác nhau. Mỗi thuốc nhuộm huỳnh quang phát ra một phổ ánh sang hẹp với một đỉnh khác biệt. Các số liệu phát ra đƣợc lƣu ghi lại trong máy tính. Sau khi quá trình chạy điện di kết thúc, chuỗi các tín hiệu huỳnh quang đƣợc chuyển ngƣợc thành thơng tin trình tự nucleotit [70]
Kết quả đƣợc xử lý trên phần mềm PC/gene, Gendoc, BioEdit và đƣợc so sánh với trình tự đã đƣợc cơng bố trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế bằng chƣơng trình BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) qua dữ liệu của DDGJEMBL để tìm xem mức độ tƣơng đồng của các chủng nghiên cứu với loài nào là lớn nhất [5].
Kết quả đọc trình tự 16S rRNA của các chủng vi khu n có khả năng tạo màng sinh vật mạnh đƣợc thực hiện với sự giúp đỡ của Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học – Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.3.7. hương pháp thống ê sinh học
Các kết quả thu đƣợc là kết quả của ít nhất 3 lần thí nghiệm lặp lại, các số liệu đƣợc xử lý bằng thông kê sinh học thông qua các phần mềm Excel, Microsoft Word để đảm bảo độ tin cậy.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật c khả năng tạo biofilm
Chúng tôi chọn các địa điểm nƣớc đang và có nguy cơ bị ô nhiễm nitơ để phân lập tuyển chọn vì tại các địa điểm này có thể tồn tại nhiều chủng vi khu n có khả năng ph n giải nitơ đồng thời có hoạt tính tạo màng sinh vật.
Địa điểm lấy mẫu tại xã Dƣơng Nội, là một vùng chuyên nuôi lợn giống để cung cấp cho nhiều địa phƣơng trong và ngoài Hà Nội, nƣớc thải ra từ các chuồng nuôi lợn nhỏ lẻ đƣợc đƣa thẳng vào hệ thống cống thoát nƣớc. Khi tiến hành lấy mẫu, chúng tôi nhận xét thấy, mẫu nƣớc thải bốc mùi khó chịu, có màu xanh đen, độ đậm đặc cao.
Địa điểm lấy mẫu là trại nuôi lợn xã T n Ƣớc là khu vực chăn nuôi tập trung, có quy hoạch, nƣớc và chất thải của động vật đã đƣợc xử lý trƣớc khi đƣợc đƣa ra mơi trƣờng. Do đó, mẫu nƣớc lấy từ địa điểm này về cảm quan là trong hơn, t đậm đặc hơn so với mẫu lấy ở xã Dƣơng Nội.
Điểm lấy mẫu từ trại nuôi vịt xã Trung Tú - Ứng Hịa có đặc trƣng là nguồn các chất thải từ trại nuôi vịt đƣợc đổ trực tiếp ra ao.
Từ các mẫu nƣớc thải thu thập đƣợc, chúng tôi phân lập đồng thời trên cả mơi trƣờng Winogradski 1 và 2. Trong đó, tr n mơi trƣờng Winogrask 1 chúng tôi mong muốn phân lập đƣợc các chủng vi khu n có khả năng chuyển hóa amoni thành nitrit. Tr n môi trƣờng Winograski 2 chúng tôi mong muốn phân lập đƣợc các chủng vi khu n có khả năng chuyển hóa nitrit thành nitrat. Quá trình chuyển hóa amoni thành nitrit và chuyển hóa nitrit thành nitrat là 2 quá trình liên tiếp trong q trình nitrat hóa, vi khu n sử dụng nitơ làm nguồn cung cấp năng lƣợng.
Số lƣợng vi sinh vật phân lập đƣợc trên từng địa điểm ứng với mỗi môi trƣờng đƣợc thể hiện ở bảng 2.
Bảng 2. Số lƣợng vi khuẩn phân lập đƣợc tại các địa điểm nghiên cứu.
Địa điểm Môi trƣờng
Winogradski 1
Môi trƣờng Winogradski 2
Tổng số chủng phân lập
Trại nuôi lợn xã Tân
Ƣớc – Thanh Oai 7 4 11 Hệ thống thoát nƣớc xã Dƣơng Nội – Hà Đông 8 9 17 Trại nuôi vịt xã Trung Tú - Ứng Hòa 3 4 7 Tổng số chủng phân lập 18 17 35
Qua bảng 2 cho thấy, sau 3 ngày nuôi cấy, số chủng vi khu n phân lập đƣợc