Quan sát hình 14 ta thấy, các chủng H2.2; LD2.2; T2.2; đều có khả năng tạo thành màng nổi, riêng chủng T4.1 không tạo màng nổi.
Chủng T2.2 tạo thành màng nổi sớm nhất, nhiều nhất và dày nhất. Chủng H2.2 và LD2.2 cho màng nổi mỏng và t hơn. Kết quả tạo màng nổi là một kết quả khá thú vị, cho phép các chủng vi sinh vật có thể đƣợc áp dụng để xử lý nƣớc thải trong các điều kiện khác nhau.
3.4.2. Ảnh hiển vi màng nổi của các chủng nghiên cứu
Từ thí nghiệm tạo màng nổi của các chủng nghiên cứu, chúng tôi tiến hành chụp ảnh hiển vi để quan sát cấu trúc bề mặt của màng nổi. Quan sát trên hình 15 cho thấy, các màng sinh vật đều đƣợc cấu tạo bởi lớp ngoại bào nằm bao phủ hoặc xen kẽ với các tế bào vi khu n. Từ đó, tạo thành một lớp màng dày đặc, có khả năng bám dính tốt.
Trên ảnh hiển vi (hình 15), cả 3 chủng vi khu n H2.2, LD2.2, T2.2 đều là các trực khu n trơn nhẵn, khơng có lơng, xếp dạng chuỗi hoặc nằm đan xen với nhau.
Hình 15. Ảnh hiển vi màng nổi của các chủng vi khuẩn (X 10000 lần) A. Chủng H2.2; B. Chủng LD2.2; C. Chủng T2.2
3.4.3. Khả năng tạo biofilm bề mặt
Biofilm bề mặt là sự hình thành màng sinh vật bám dính trên các bề mặt rắn nhƣ nhựa, thủy tinh… Khi tiến hành thử nghiệm khả năng hình thành màng sinh vật trên bề mặt vật liệu nhựa PE (ống eppendorf) bằng phƣơng pháp nhuộm tím kết tinh, có thể quan sát thấy rõ sự bám dính của tế bào quanh thành ống. Mức độ tạo biofilm của các chủng nghiên cứu là khác nhau dựa vào sự hiện màu khi nhuộm tím kết tinh.
Hình 16. Khả năng tạo biofilm trên vật liệu nhựa
Kết quả hình 16 cho thấy, cả bốn chủng đều tạo màng tốt trên vật liệu nhựa PE. Trong đó, chủng T2.2 cho màng rõ nhất và nhiều nhất. Nhƣ v y, ngồi mơi trƣờng nuôi cấy lỏng, mơi trƣờng đặc thì các chủng nghiên cứu còn tạo đƣợc biofilm trên vật liệu nhựa PE. Đ y là nghi n cứu đầu ti n để định hƣớng cho các nghiên cứu tiếp theo về việc tạo biofilm của các chủng nghiên cứu trên các vật liệu mang khác nhau ứng dụng vào trong vấn đề xử lý nƣớc thải. Kết quả này tƣơng tự với những kết quả nghiên cứu của Nguyễn Quang Huy và cộng sự trƣớc đ y cho thấy các chủng có hoạt tính tạo màng biofilm trong mơi trƣờng dịch thể cao đều có hoạt tính tạo biofilm trên nhiều loại vật liệu mang khác nhau trong đó có nhựa PE tƣơng tự nhƣ ống eppendorf [59].
3.5. Các ếu tố ảnh hƣởng đến khả năng tạo biofilm của các chủng phân lập
Khả năng tạo biofilm của các chủng vi sinh vật phụ thuộc nhiều yếu tố vật lý và hóa học nhƣ thành phần mơi trƣờng, nồng độ oxy, pH, nhiệt độ... Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tác động của một số điều kiện nhƣ nhiệt độ, pH lên các chủng phân lập có hoạt tính tạo biofilm với mục đ ch có thể áp dụng các chủng này trong việc tạo chế ph m xử lý nƣớc thải trong tƣơng lai.
3.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tố có ảnh hƣởng lớn đến sự tồn tại và phát triển của vi sinh vật. Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp cũng làm giảm hoặc mất sự hoạt động của các enzyme từ đó ảnh hƣởng đến sự tạo thành biofilm. Mỗi vi khu n có một dải nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển. Chúng tơi tiến hành thử nghiệm khả năng phát triển
và tạo màng của 4 chủng vi khu n đã ph n lập đƣợc trên các nhiệt độ khác nhau. Kết quả thu đƣợc thể hiện trên hình 17.
Hình 17. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo biofilm (Giá trị OD570 ở nồng độ đã pha loãng 10 lần)
Kết quả ở hình 17 cho thấy cả 3 chủng vi khu n là H2.2; LD2.2; T2.2 đều tạo biofilm mạnh nhất ở nhiệt độ 37oC (giá trị OD570 từ 0,338 đến 0,544). Sự thay đổi nhiệt độ cũng làm ảnh hƣởng mạnh mẽ đến khả năng tạo biofilm của các chủng H2.2, LD2.2, T2.2. Trong đó, chủng H2.2 là có sự thay đổi mạnh nhất. Tại 30oC, giá trị OD570 của chủng H2.2 là 0,152; tại 37oC, giá trị này là 0,534; tại 50oC, giá trị này là 0,296. Nhƣ vậy, ngoài nhiệt độ tối ƣu là 37oC, chủng H2.2 vẫn tạo biofilm nhƣng cho hoạt tính thấp. Tƣơng tự, chủng LD2.2 và T2.2 cũng tạo biofilm ở nhiệt độ 30oC và 50oC nhƣng khơng cho hoạt tính biofilm mạnh (giá trị OD570 của chủng LD 2.2 và T2.2 tại 30oC lần lƣợt là 0,194 và 0,265; tại 50oC là 0,171 và 0,481).
Riêng chủng T4.1 cho giá trị OD570 ở nhiệt độ 50o C là cao nhất (0,189). Tuy nhiên, ở 37oC chủng T4.1 vẫn tạo biofilm mạnh cho giá trị OD570 là 0,18. Nhiệt độ 37oC cũng là nhiệt độ sinh trƣởng tốt cho cả 4 chủng vi khu n và cũng phù hợp với điều kiện tại địa điểm thu mẫu.
Điều này cho thấy rằng nhiệt độ 37oC thích hợp cho nhiều chủng vi khu n phân lập trong môi trƣờng ô nhiễm ở Việt Nam phát triển và tạo màng sinh vật. Kết quả này đã chứng minh cho đặc điểm của biofilm là một cơ chế giúp vi sinh vật tồn tại và phát triển trong điều kiện môi trƣờng kém thuận lợi.
Các kết quả thu đƣợc này cũng khá phù hợp với các kết quả từ nghiên cứu của Nguyễn Quang Huy và cộng sự [60].
Theo nghiên cứu của A. Hostacka và cộng sự khả năng tạo biofilm của 8 chủng nghiên cứu của loài Pseudomonas aeruginosa (3 chủng), Klebsiella
pneumoinae (2 chủng), Vibrio cholerae non O1 (2 chủng), Vibrio cholera O1 (1
chủng) ở 37oC giảm từ 46,4 – 98,4% so với khả năng tạo biofilm của các loài này ở 30oC. Ngƣợc lại, có 5 chủng thuộc loài Pseudomonas aeruginosa (1 chủng), Klebsiella pneumoinae (3 chủng), Vibrio cholerae non - O1 (1 chủng) khả năng tạo
biofilm ở 37oC tăng từ 103 – 143% so với khả năng tạo biofilm ở 30o
C [43].
3.5.2. Ảnh hưởng của pH
pH cũng là một trong số những đặc điểm của điều kiện mơi trƣờng có thể ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của vi sinh vật, đồng thời ảnh hƣởng đến khả năng hình thành màng sinh vật của chúng. Sự thay đổi pH làm cho các hoạt động sinh lý của vi khu n thay đổi. Khi pH mơi trƣờng thay đổi thì sẽ làm mất sự thăng bằng về trao đổi chất giữa môi trƣờng và vi sinh vật dẫn đến sự phát triển của vi sinh vật có thể chậm hoặc ngừng lại. Khi tiến hành nuôi cấy các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc tr n các mơi trƣờng dinh dƣỡng có giá trị pH khác nhau, chúng tơi thu đƣợc kết quả trên hình 18.
Hình 18. Ảnh hưởng của p đến khả năng tạo biofilm (Giá trị OD570 ở nồng độ đã pha lỗng 10 lần)
Trên hình 18 cho thấy, chỉ duy nhất chủng T2.2 là thể hiện sự ảnh hƣởng rõ rệt của pH đến khả năng phát triển và tạo màng sinh vật. Chủng T2.2 có thể tạo màng sinh vật tốt nhất ở pH 7. Chủng H2.2 cũng phát triển tốt ở pH 7 tuy nhiên, mức độ phát triển không cao bằng chủng T2.2. Các chủng LD2.2 và T4.1 đều phát triển tốt ở pH 6,5. Theo QCVN 01 - 79 : 2011/BNNPTNT Yêu cầu về vệ sinh nƣớc thải chăn nuôi ở cột B (phụ lục 4), pH nƣớc thải cho phép từ 5,5 đến 9. Nhƣ vậy, cả 4 chủng nghiên cứu đều phát triển tốt ở mơi trƣờng nƣớc thải có độ pH cao.
Kết quả của chúng tôi thu đƣợc cũng phù hợp với nghiên cứu của một số tác giả quốc tế. Theo nghiên cứu của A. Hostacka và cộng sự, ảnh hƣởng của pH 5,5; 7,5 và 8,5 đến các chủng thuộc loài Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoinae, Vibrio cholerae non - O1 và O1 cho thấy, khả năng tạo
biofilm tăng khoảng 169% từ pH 5,5 – 7,5; và tăng 229% từ pH môi trƣờng trong khoảng 5,5 – 8,5 [13].
3.6. Phân loại các chủng vi khuẩn dựa trên gen 16S rRNA
Trong 4 chủng vi khu n phân lập đƣợc là T2.2, H2.2, LD2.2 và T4.1 thì chủng LD2.2 có khả năng phát triển khá chậm, khó sinh trƣởng và nuôi cấy trên mơi trƣờng thạch LB. Vì vậy, trong thí nghiệm định danh vi khu n dựa trên phân
tích gen 16S rRNA do điều kiện thời gian nên chúng tôi bƣớc đầu tiến hành đối với 3 chủng T2.2, H2.2 và T4.1.
Kết quả hình 19 cho thấy, trình tự gen 16S rRNA của chủng T2.2 (phụ lục 2) tƣơng đồng 99,9 % (1448/1450 bp) với đoạn 16S của Bacillus licheniformis_X684 trong ngân hàng gen.
Bacillus licheniformis là vi khu n Gram dƣơng thuộc chi Bacillus, hình que,
có khả năng di động và khả năng tạo nội bào tử gần nhƣ hình cầu giúp nó tồn tại trong thời gian dài khi gặp điều kiện sống khắc nghiệt. Nhờ khả năng tạo đƣợc các sản ph m thƣơng mại có giá trị, nhƣ hầu hết các protease và amylase, cũng nhƣ thao tác di truyền dễ dàng mà các vi khu n chi Bacillus đƣợc xem là mơ hình nghiên cứu hiệu quả và có tính ứng dụng cao về màng sinh học [53].
Hình 19. Vị trí phân loại chủng T2.2 với các lồi có quan hệ họ hàng gần
Cùng với B. subtilis loài B. licheniformis thƣờng đƣợc ứng dụng trong xử lý nƣớc thải bởi vi khu n này có khả năng sản xuất các enzyme ngoại bào, chủ yếu là protease và lipase. Một số đặc điểm đặc trƣng của B. licheniformis nhƣ môi trƣờng sống đa dạng, dễ dàng nuôi cấy, tạo bào tử, khả năng chịu đựng cao với điều kiện
khắc nghiệt của mơi trƣờng. Những đặc điểm này giúp lồi B. licheniformis đƣợc
dùng nhiều trong việc tạo chế ph m xử lý nƣớc thải [48].
Kết quả trên hình 20 là vị trí phân loại chủng H2.2 với các lồi có quan hệ họ hàng gần khi so sánh trình tự gen 16S rRNA của chủng H2.2 (phụ lục 1). Đoạn trình tự gen này tƣơng đồng 98,5 % (1379/1400 bp) với đoạn 16S rRNA của
Sphingobacterium multivorum_AB680717 trong ngân hàng gen.
Hình 20. Vị trí phân loại chủng H2.2 với các lồi có quan hệ họ hàng gần Sphingobacterium multivorum là vi khu n Gram âm, thƣờng đƣợc tìm thấy Sphingobacterium multivorum là vi khu n Gram âm, thƣờng đƣợc tìm thấy
trong đất và nƣớc. Yang và cộng sự đã ph n lập đƣợc chủng vi khu n
Sphingobacterium multivorum từ bùn hiếu khí có khả năng làm giảm tác dụng có
hại của thuốc trừ sâu acetanilide mefenacet (2-(1,3- benzothiazol-2-yloxy)-N- methylacetanilide) [80]. Chúng tôi cũng đang thử nghiệm khả năng ph n hủy một số chất độc trong mơi trƣờng từ chủng H2.2.
Hình 21 thể hiện vị trí phân loại chủng T4.1 với các lồi có quan hệ họ hàng gần khi so sánh kết quả trình tự gen 16S rRNA của chủng T4.1 (phụ lục 3). Đoạn gen này tƣơng đồng 100 % (1350/1350 bp) với đoạn 16S rRNA của Acinetobacter
Hình 21. Vị trí phân loại chủng T4.1 với các lồi có quan hệ họ hàng gần Acinetobacter soli thuộc nhóm vi sinh vật đất quan trọng. Chúng giúp cho Acinetobacter soli thuộc nhóm vi sinh vật đất quan trọng. Chúng giúp cho
q trình khống hóa của đất, tạo các hợp chất có mùi. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các vi khu n thuộc chi Acinetobacter có li n quan đến sự phân hủy sinh học, lọc và loại bỏ các hợp chất vô cơ và hữu cơ do con ngƣời thải ra [30]. Các chủng thuộc loài Acinetobacter đƣợc phân lập nhiều tại các khu vực ô nhiễm dầu hoặc hệ thống xử lý nƣớc thải có hàm lƣợng photpho cao.
3.7. Khả năng chu ển h a nitơ
Bốn chủng vi khu n có khả năng phát triển và tạo màng sinh vật tốt đƣợc nghiên cứu tìm hiểu về khả năng chuyển hóa nitơ nhằm mục đ ch định hƣớng nghiên cứu ứng dụng vào vấn đề xử lý nƣớc thải trong chăn ni, loại nƣớc có nồng độ nitơ cao.
Tr n môi trƣờng Winograsdki 1, nguồn nitơ đƣợc vi khu n sử dụng là (NH4)2SO4 nên các chủng vi khu n phân lập đƣợc gồm H2.2 và T4.1 sẽ đƣợc chúng tơi tiến hành thử khả năng chuyển hóa amoni. Hai chủng LD2.2 và T2.2 đƣợc phân lập từ mơi trƣờng Winogradski 2 có nguồn nitơ là NaNO2 sẽ đƣợc chúng tơi tiến hànhthử hoạt tính chuyển hóa nitrit.
3.7.1. Khả năng chuyển hóa amoni
Sau khi nuôi lắc trong môi trƣờng Winogradski 1, chủng H2.2 và T4.1 đƣợc đem thử hoạt tính chuyển hóa amoni theo phƣơng pháp xác định độ giảm nồng độ amoni theo thời gian nuôi cấy. Kết quả thu đƣợc khi đo độ hấp thụ quang học của phức tạo bởi NH4+ và hypochloride ở bƣớc sóng 640 nm đƣợc đối chiếu với đƣờng chu n và độ giảm nồng độ amoni kết quả đƣợc trình bày ở hình 22.
Hình 22. Khả năng chuyển hóa amoni của các chủng H2.2 và T4.1
Mức độ chuyển hóa amoni của chủng H2.2 và T4.1 sau 5 ngày đầu là ít. Sự biến đổi rõ rệt về nồng độ amoni của hai chủng thể hiện trong giai đoạn từ 5 đến 20 ngày. Mức độ chuyển hóa amoni của chủng H2.2 và T4.1 là nhƣ nhau.
Nồng độ amoni ban đầu là 1367,5 (mg/l), sau 5 ngày chủng H2.2 chuyển hóa, hàm lƣợng amoni là 1178,2 (mg/l). Hiệu suất chuyển hóa đạt 13,8%. Tuy nhiên, tiếp tục nuôi trong giai đoạn từ 5 đến 20 ngày thì nồng độ amoni đã giảm đáng kể. Kết thúc 20 ngày nuôi lắc, nồng độ amoni còn lại là 158,3 (mg/l). Hiệu suất chuyển hóa là 88,4%.
Chủng T4.1 cũng có khả năng chuyển hóa tƣơng tự chủng H2.2. Tuy nhiên, hiệu suất của chuyển hóa thấp hơn. Nồng độ amoni ban đầu là 1035,2 (mg/l). Sau 20 ngày nuôi lắc, nồng độ amoni còn lại là 230,7 (mg/l) tƣơng ứng với hiệu suất chuyển hóa đạt 77,7%. Nhƣ vậy, với kết quả thu đƣợc hai chủng H2.2 và T4.1 có khả năng chuyển hóa amoni tốt, có thể thực hiện những nghiên cứu s u hơn ứng dụng trong vấn đề xử lý nƣớc thải.
Nghiên cứu của Lại Thúy Hiền và cộng sự đã ph n lập một số chủng vi khu n chuyển hóa amoni từ mẫu nƣớc và bùn của ao nuôi tôm. các chủng vi khu n phân lập đƣợc có khả năng chuyển hóa amoni là 87% (chủng PV) và 89% (chủng QĐ) [8]. Nhƣ vậy, kết quả chúng tôi thu đƣợc là phù hợp với kết quả của các nhóm nghiên cứu trong nƣớc đã công bố tuy nhiên đ y lại là cơng tr nh đầu tiên trình bày về các chủng có hoạt tính tạo biofilm ở Việt Nam đồng thời có hoạt tính chuyển hố các hợp chất của nitơ.
3.7.2. Khả năng chuyển hóa nitrit
Song song với nghiên cứu về chuyển hóa amoni, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng chuyển hóa nitrit thành nitrat của chủng LD2.2 và T2.2 bằng thí nghiệm xác định độ tăng nồng độ nitrat trong dịch lắc sau những khoảng thời gian 5 ngày, 10 ngày và 20 ngày thu đƣợc kết quả thể hiện trên hình 23.
Hình 23. Khả năng chuyển hóa nitrit của chủng LD2.2 và T2.2
Kết quả trên hình 23 cho thấy cả hai chủng LD2.2 và T4.1 đều có khả năng chuyển hóa nitrit thành nitrat, nồng độ nitrat tăng theo thời gian nghiên cứu.
Chủng T2.2 có khả năng chuyển hóa cao hơn. Nồng độ nitrat ban đầu của hai chủng là tƣơng đối đồng đều (LD2.2 là 5,6 (mg/l); T2.2 là 6,1 (mg/l)). Sau 20 ngày nghiên cứu, nồng độ nitrat do chủng LD2.2 chuyển hóa đạt 9,8 (mg/l), hiệu suất chuyển hóa là 75%; do chủng T2.2 chuyển hóa đạt 18, 9 (mg/l), hiệu suất chuyển hóa đạt 209,8%. Nhƣ vậy, hàm lƣợng nitrat thu đƣợc từ chủng T2.2 cao gần gấp 3 lần so với lƣợng nitrat thu đƣợc từ chủng LD2.2. Kết quả thu đƣợc phù hợp với nghiên cứu trong nƣớc trƣớc đ y của Lại Thúy Hiền và cộng sự [8].
KẾT LUẬN
1. Đã phân lập, tuyển chọn đƣợc 35 chủng vi khu n có khả năng tạo biofilm từ các địa điểm ô nhiễm: trại nuôi lợn xã T n Ƣớc – Thanh Oai, trại vịt xã Trung Tú - Ứng Hịa và hệ thống thốt nƣớc xã Dƣơng Nội – Hà Đơng. Trong đó 4 chủng ký hiệu là T2.2; LD2.2; H2.2; T4.1 có khả năng tạo biofilm mạnh nhất.
2. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của cả 4 chủng là 370C. pH 7 là thích hợp cho chủng T2.2 và H2.2 phát triển. Chủng T4.1 và LD2.2 phát triển tốt ở pH môi trƣờng 6,5.
3. Hiệu suất chuyển hóa amoni của chủng H2.2 là 88,4%; chủng T4.1 là 77,7%; chủng T2.2 và LD 2.2 có khả năng chuyển hóa nitrit tƣơng ứng là 18,9 mg/l và 9,8 mg/l sau 20 ngày nuôi cấy.