Chương 1 : TỔNG QUAN
1.3 Ơ nhiễm vi sinh vật trong nước sinh hoạt và nước thải
1.3.3 Các phương pháp định lượng vi sinh vật
Sự hiện diện của vi sinh vật có thể định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau như:
- Phương pháp đếm trực tiếp - Phương pháp đếm khuẩn lạc
- Phương pháp đếm khuẩn lạc trên màng lọc - Phương pháp MPN (Most Probable Number) - Phương pháp đo độ đục
- Phương pháp đo OD
Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc trên màng lọc. Phương pháp đếm khuẩn lạc trên màng lọc là phương pháp cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Phương pháp này có đặc điểm là cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường và điều kiện nuôi cấy.Phương pháp này thường được áp dụng cho các mẫu lỏng như nước, sữa và được đánh giá là cho kết quả chính xác hơn so với phương pháp ước đoán MPN. Các mẫu chất lỏng được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ nhỏ hơn kích thước của vi sinh vật. Sau khi lọc, vi sinh vật được giữ lại trên màng lọc. Màng được đặt trên môi trường agar hay trên giấy thấm được ngấm môi trường nuôi cấy chất lỏng đã chọn và ủ trong
điều kiện xác định. Sau khi ủ, đếm các khuẩn lạc xuất hiện trên bề mặt màng lọc.
Thiết bị lọc có thể bằng thủy tinh, kim loại hoặc nhựa bao gồm phễu lọc giá đỡ, màng lọc, bộthiết bịhỗtrợ hút chân khơng và bình chứa. Màng lọc có lỗ lọc nằm trong khoảng 0,1 –1 µm. Các loại màng lọc dùng cho việc phân tích tổng số vi sinh vật thường có kích thước lỗ lọc là 0,47 µm. Đường kính màng lọc có nhiều kích cỡ khác nhau phù hợp với đường kính của phễu lọc, đường kính phổ biến là 45mm, bề dày của màng khoảng 120 µm. Đặt màng lọc lên môi trường thạch nuôi cấy sao cho mặt trên của màngở phía trên, vi khuẩn khơng tiếp xúc trực tiếp với môi trường nhưng các thành phần của môi trường dễ dàng thấm qua màng và nuôi vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc. Một số loại màng lọc có gắn các lưới kỵ nước chỉ cho phép khuẩn lạc phát triển trong mỗi ô của lưới và không lan sang các ô khác tạo điều kiện thuận tiện khi đếm khuẩn lạc.
Trong phương pháp này cần thực hiện pha loãng mẫu bậc 10 liên tiếp sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính tốn. Mật độ tế bào quá lớn làm các khuẩn lạc chồng chéo lên nhau hoặc tạo thành màng sinh khối. Ngược lại số lượng lạc khuẩn trên một đĩa quá nhỏ sẽ khơng có giá trị thống kê. Số lượng lạc khuẩn tối ưu từ 25– 250 khuẩn lạc/đĩa.
Số lượng lạc khuẩn xuất hiện trên đĩa petri phụ thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môi trường và điều kiện ủ, kết quả đếm thường được trình bày bằng số đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU/ml (colony –forming unit).
Tính tốn tổng sốkhuẩn lạctrên 1 đơn vị thểtích theo cơng thức sau [7]:
N (CFU/g hay CFU/ml) =
i i idV n V d n V d n C ... 2 2 2 1 1 1 Trong đó:
∑C: Tổng sốkhuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri đã chọn ni: Sốhộp petri cấy mẫu tại độpha loãng thứi
di: Nồng độ pha loãng thứi