CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ P PASTORIS
1.3.1. Đặc điểm của P pastoris
Nấm men P. pastoris thuộc họ Saccharomycetaceae, có khả năng sử dụng
methanol nhƣ nguồn dinh dƣỡng carbon chính. Tuy nhiên, nồng độ methanol khơng đƣợc q nhiều và phải đƣợc điều khiển chặt chẽ để tránh tổn hại và gây độc đối với tế bào nấm men. P. pastoris là sinh vật nhân chuẩn nên có nhiều ƣu thế khi dùng để biểu hiện các protein của các sinh vật nhân chuẩn, ví dụ nhƣ có q trình gấp xếp protein và quá trình cải biến sau dịch mã.
P. pastoris sử dụng nguồn carbon nhƣ glucose, glycerol và methanol. Nguồn
nitrogen sử dụng là nguồn hữu cơ và vô cơ nhƣ: peptone, casein, dịch chiết thịt (meat extract), dịch chiết nấm men (yeast extract) các muối ammonium muối nitrate,… Ngồi ra, nó cịn sử dụng các chất khống nhƣ: Mn, Zn, P, S,… và các vitamin nhƣ vitamin B12,.. Vì P. pastoris là vi sinh vật hiếu khí, nên cần nguồn oxy để phát triển [23].
Đặc điểm sinh hóa di truyền, P. pastoris có promoter mạnh AOX (promoter alcohol oxidase), có thể sử dụng methanol nhƣ nguồn carbon, trong mơi trƣờng khơng có glucose bằng cách oxy hóa methanol thành formaldehyde và hydrogen peroxide nhờ sự xúc tác của enzym alcohol oxydase (AOX) [21]. Sự biểu hiện của gen mã hóa enzym AOX theo một nguyên tắc chặt chẽ: khi nấm men phát triển trên glucose hoặc ethanol thì enzym alcohol oxydase ít đƣợc biểu hiện trong tế bào. Tuy nhiên, khi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng chứa methanol thì enzym này chiếm khoảng 35% tổng protein tế bào. Có hai gen alcohol oxydase là AOX1 và AOX2, các vùng mã hóa protein của các gen này lớn tƣơng đƣơng nhau. Khi nấm men phát triển trên glycerol thì khơng có các phân tử RNA thơng tin của cả hai gen xuất hiện. Promoter của AOX1 và AOX2 có cấu trúc tƣơng tự nhau và cùng một vùng ức chế để kháng lại sự biểu hiện gen [55]. AOX là một promoter mạnh và hoạt động rất chặt chẽ, nó sẽ cảm ứng và điều khiển việc sản xuất các protein ngoại [16].
1.3.2. Ƣu điểm của hệ thống biểu hiện P. pastoris
Hệ thống tế nấm men P. pastoris có hạn chế là cần thời gian biểu hiện dài (5-6 ngày), hàm lƣợng tiết protein không cao nhƣ ở E. coli nhƣng vì protease HIV-1 là một protease đƣợc tạo ra trong tế bào sinh vật nhân chuẩn nên chúng tôi chọn chủng tế bào nấm men P. pastoris với những ƣu điểm sau:
Trƣớc hết, P. pastoris là một sinh vật nhân chuẩn, nên có thể cung cấp mơi
trƣờng thích hợp cho protein tái tổ hợp tiết và gấp cuộn cũng nhƣ thực hiện các cải biến sau dịch mã nhƣ tế bào động vật [41], đây là điều cần thiết để bảo đảm protease HIV-1 có hoạt tính. Đặc biệt, với hệ thống P. pastoris, khi protein đƣợc biểu hiện ra nếu gây độc đối với tế bào thì protein đó vẫn đƣợc duy trì sản xuất trong tế bào [16].
Ở hệ thống biểu hiện E. coli, vector mang gen mục tiêu dạng vòng sẽ đƣợc
biến nạp vào tế bào vi khuẩn. Nhƣng trong hệ thống biểu hiện P. pastoris, vector biểu hiện mang gen mục tiêu đƣợc cắt bằng enzym giới hạn để tạo ra dạng thẳng và dung hợp vào bộ gen của nấm men P. pastoris theo con đƣờng tái tổ hợp tƣơng
đồng tạo ra thể biến nạp ổn định [12]. Hơn nữa, P. pastoris có một promoter mạnh AOX1 (lƣợng protein tạo ra chiếm đến 30% tổng số protein tế bào). Thành phần môi trƣờng nôi cấy đơn giản, chất cảm ứng là methanol - rẻ tiền hơn so với chất cảm ứng của hệ thống biểu hiện E coli. Nhờ khả năng sử dụng methanol nhƣ nguồn carbon chính nên có thể hạn chế đƣợc sự nhiễm các lồi vi sinh vật khác bởi sự có mặt nhiều methanol trong môi trƣờng nuôi cấy.
Ƣu điểm tiếp theo, P. pastoris có thể phát triển với mật độ cao hơn nhiều lần so với S. cerevisiae [52]. P. pastoris có khả năng phát triển ở pH từ 3 tới 7, do đó có thể điều chỉnh pH để giảm thiểu tối đa hoạt động của protease đối với protein tiết ra [37]. Có thể biểu hiện protein với hàm lƣợng từ milligram tới gram cả trong nghiên cứu phịng thí nghiệm lẫn trong sản xuất quy mơ cơng nghiệp [34].
Một ƣu điểm quan trọng nữa, vector biểu hiện pPIC9 có trình tự nhân tố α giúp protein mục tiêu đƣợc tiết ra ngồi mơi trƣờng nên dễ thu nhận hơn so với các hệ thống biểu hiện khác, đồng thời các protein của bản thân loại nấm men này đƣợc tiết ra mơi trƣờng ở mức độ thấp nên q trình tinh sạch và thu nhận protease HIV-1
1.3.3. Chủng nấm men P. pastoris biểu hiện protease HIV-1
Phần lớn các chủng P. pastoris đƣợc sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp
đều bị gây đột biến gen HIS4 và đều có nguồn gốc từ chủng dại NRRL-Y 11430
(Northern Regional Research Laboratories, Peoria, IL). Những chủng đột biến gen
HIS4 khơng có khả năng tổng hợp histidinol dehydrogenase. Nên để sinh trƣởng
đƣợc trên mơi trƣờng cơ bản thì cần bổ sung thêm histidine. Do vậy, có mặt gen
HIS4- của P. pastoris đƣợc xem là một chỉ thị nhận biết chủng chứa vector biểu hiện
sau biến nạp vì trên vector biểu hiện chứa gen HIS4 bình thƣờng.
Xét về khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng methanol, các chủng P. pastoris có 3 kiểu hình là Mut+, Muts, Mut- [22; 38]. Chủng có kiểu hình Mut+ mang cả 2 gen
AOX1 và AOX2 có khả năng sinh trƣởng mạnh trên mơi trƣờng methanol nhƣ dạng
kiểu dại và có khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp tốt nhờ có promoter AOX1. Các
chủng Mut- rất mẫn cảm với nồng độ methanol cao [38]. Do vậy, sự thay đổi đột ngột
nồng độ methanol trong môi trƣờng nuôi cấy thƣờng dẫn đến mất hoạt tính enzym AOX và thậm chí có thể giết chết tế bào nếu nồng độ chất này quá cao [51]. Tuy nhiên, nồng độ methanol thấp q có thể khơng đủ cảm ứng để bắt đầu phiên mã
[21]. Cịn chủng Muts khơng mẫn cảm với nồng độ methanol dƣ thừa cao bởi chủng
này vẫn tiêu thụ methanol nhƣng tốc độ thấp. Có nhiều chủng P. pastoris có thể
đƣợc sử dụng để biểu hiện một số loại protein tiết khác nhau (Bảng 1) [27].
Bảng 1. Một số chủng P. pastoris phổ biến đƣợc sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp [27]
Chủng Kiểu gen
Y-11430 Kiểu dại
GS115 HIS4
GS190 ARG4
GS200 HIS4ARG4
SMD1168 ∆PEP4:URA HIS4 ura3
SMD1165 HIS4 PRB1
Chủng nấm men P. pastoris SMD1168 đã đƣợc chúng tôi lựa chọn và sử
dụng trong biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1. Ngồi gen HIS4-, P. pastoris
SMD1168 cịn có gen PEP4 đã bị đột biến ở dạng PEP4-, PEP4 là gen mã hóa cho
carboxypeptidase A cần thiết cho sự kích hoạt các protease khác. Cụ thể, gen PEP4 mã hóa protease A trong khơng bào nấm men. Protease A cần thiết cho sự hoạt hóa các protease khơng bào khác nhƣ carboxypeptidase Y và protease B. Đột biến gen
PEP4 sẽ làm giảm hoạt tính của protease A và carboxypeptidase Y và giảm mạnh
hoạt tính của protease B. Nếu đột biến 2 gen PEP4 và PRB1 thì cả 3 protease sẽ
giảm hoạt tính [22]. Chính vì vậy, khi gen PEP4 bị bất hoạt sẽ là lợi thế lớn trong
việc hạn chế các protease vật chủ cắt protease ngoại lai trong q trình biểu hiện.
1.3.4. Vector nhân dịng và biểu hiện ở P. pastoris
Có 4 loại vector biểu hiện phổ biến ở P. pastoris là pHIL-D2, pPIC3.5,
pHIL-S1 và pPIC9. Vector pHIL-D2 và pPIC3.5 đƣợc sử dụng để biểu hiện protein nội bào, còn pHIL-S1 và pPIC9 đƣợc sử dụng để biểu hiện protein tiết ngoại bào [29]. Vector pPIC9 đƣợc chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này (hình 4).
Đầu 5’ promoter AOX1: nucleotide base 1-948 Vị trí mồi 5’ AOX1: nucleotide 855-875
Tín hiệu tiết (nhân tố α) (S): nucleotide 949-1218 Vị trí mồi α: nucleotide 1152-1172
Vùng đa nối: nucleotide 1192-1241
Vị trí mồi đầu 3’ AOX1: nucleotide 1327-1347 Đoạn kết thúc phiên mã 3’AOX1 (TT): nucleotide 1253-1586
Khung đọc mở (ORF) HIS4: nucleotide 4514-1980
Đoạn 3’ AOX1: nucleotide 4870-5626 pBR322 origin: bases 6708-6034
Gen kháng Ampicillin: nucleotide 713-6853
1.3.5. Cơ chế sát nhập gen ngoại lai vào hệ gen P. pastoris
Để vector biểu hiện đƣợc tích hợp vào hệ gen P. pastoris, vector biểu hiện mang gen mục tiêu đƣợc cắt mở vòng bằng enzym giới hạn ở một vị trí đã đƣợc xác định trƣớc trên gen chỉ thị HIS4 hoặc trên đoạn promoter AOX1. Khi vector mở
vòng sẽ tạo thành các đầu DNA tƣơng đồng kích thích sự tái tổ hợp của vector biểu hiện với hệ gen của nấm men, dẫn đến sự trao đổi chéo đơn và tích hợp vector vào locus tƣơng đồng [16].
Về lý thuyết khi plasmid đƣợc chuyển vào tế bào có thể xảy ra sự sát nhập vào bộ gen của tế bào theo hai phƣơng thức là chèn gen hoặc thay thế. Việc tích hợp đƣợc thực hiện bằng sự trao đổi chéo đơn giữa gen HIS4 trên vector và locus HIS4 của hệ gen P. pastoris nhờ sự mở vòng vector biểu hiện bằng enzym giới hạn (SalI hoặc StuI) cắt trình tự tƣơng ứng trên gen HIS4. Kết quả là promoter PAOX1 và gen
mong muốn đƣợc tích hợp vào hệ gen của P. pastoris tại locus HIS4. Lúc này thể
biến nạp có hiểu hình HIS4+. Kiểu hình Mut+ của chủng sau khi tái tổ hợp xảy ra
không bị thay đổi so với ban đầu.
Hình 5. Cơ chế trao đổi chéo xảy ra tại locus his4 giữa bộ gen của tế bào với vector biểu hiện [29]
1.3.6. Quá trình tiết protein ngoại bào ở P. pastoris
Các protein sau khi đƣợc tổng hợp ra thƣờng trải qua quá trình biến đổi sau dịch mã. Trong quá trình này, các protein đƣợc hoàn thiện về mặt cấu trúc, hình thành các trung tâm hoạt động và tạo nên cấu trúc bền vững của protein. Các protein tạo ra sau q trình chế biến có thể đƣợc giữ lại trong tế bào chất hoặc đƣợc tiết ra ngoài tế bào. Những protein đƣợc tiết ra ngoài tế bào gọi là protein ngoại bào. Ở P.
pastoris, q trình tiết của protein ngoại bào cũng địi hỏi phải có một trình tự tiết gồm các acid amin đặc biệt hay cịn gọi là tín hiệu dẫn ở đầu tận cùng N để giúp cho protein có thể đi qua màng tế bào [34]. Tùy thuộc vào tín hiệu dẫn khác nhau mà protein có thể đƣợc vận chuyển đến các bào quan khác nhau hoặc đƣợc tiết khỏi tế bào. Trình tự tiết cho protein ngoại lai đã đƣợc sử dụng rất có hiệu quả trong một số vector biểu hiện, nhờ đó mà một lƣợng lớn protein ngoại lai đã đƣợc tiết ra ở mức độ cao, ví dụ nhƣ tín hiệu dẫn α-MF prepro gồm khoảng 89 acid amin có nguồn gốc từ S. cerevisiae [32]. Tín hiệu này giúp protein đi qua màng của mạng lƣới nội chất dễ dàng. Trong khi chuyển vào lƣới nội chất, trình tự tiết α-MF prepro của protein sẽ đƣợc loại bỏ khỏi sản phẩm dịch mã sơ cấp và protein đƣợc tiết ra môi trƣờng là các protein hồn chỉnh. Q trình này địi hỏi 3 loại enzym phân hủy protein là: (1) peptidase cắt 19 acid amin ở vùng pre; (2) endopeptidase đƣợc mã hóa bởi gen
KEX2 sẽ cắt acid amin Lys và Arg ở đầu tận cùng C nối giữa α-MF prepro với
protein ngoại lai; (3) enzym dipeptid amino peptidase, sản phẩm của gen STE13, sẽ loại bỏ gốc Glu-Ala từ đầu tận cùng N của protein ngoại lai. Đồng thời trong khi đi vào lƣới nội chất protein ngoại bào còn trải qua sự biến đổi khác nhƣ q trình glycosyl hóa.
Sau khi đƣợc chế biến trong mạng lƣới nội chất, protein sẽ đƣợc vận chuyển đến thể golgi, tại đây chúng sẽ đƣợc bao gói trong các túi tiết và dung hợp với màng tế bào để tiết ra ngoài [4].
Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Chủng vi sinh vật
- Chủng vi khuẩn E. coli DH5α và chủng nấm men P. pastoris SMD1168 của hãng Invitrogen.
2.1.2. Các hóa chất, nguyên liệu khác
- Đoạn gen mã hóa protease HIV-1 trong vector nhân dịng pCR2.1 là kết quả của nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể, 2012.
- Plasmid pPIC9 và kit nhân dòng trực tiếp sản phẩm PCR pCR2.1 TA cloning từ
hãng Invitrogen:
- Enzym giới hạn, nHOT Taq DNA polymerase, hỗn hợp dNTP và Kit PCR từ hãng Enzynomics
- Thang chuẩn DNA và protein đƣợc mua từ hãng Fermentas.
- Kit tách và tinh sạch plasmid từ vi khuẩn E. coli từ hãng Bioneer và Qiagen - Các hóa chất dùng trong phƣơng pháp nhiệt biến nạp vào E. coli
- Thành phần các hóa chất trong điện biến nạp vào P. pastoris - Thành phần hóa chất dùng trong phƣơng pháp điện di SDS-PAGE - Thành phần các hóa chất dùng trong phƣơng pháp lai Western blot
+ Dung dịch chuyển màng
+ Phosphate buffer saline (PBS) 1lit – 10X
Tất cả hòa tan trong 800ml nƣớc cất, sau đó thêm nƣớc dẫn đến thể tích 1lit + Tween PBS (0.1% Tween)
+ Dung dịch đệm Alkaline phosphatase (AP) + Dung dịch BCIP
+ Dung dịch NBT
+ Dung dịch hiện màu: 10ml dung dịch đệm Alkaline phosphatase + 66µl dung dịch NBT + 33µl dung dịch BCIP
- Thành phần các loại môi trƣờng:
+ Thành phần môi trƣờng LB: 0.5% cao nấm men, 1% trypton, 1% NaCl, nƣớc cất + Thành phần môi trƣờng LB rắn: 0.5% cao nấm men, 1% trypton, 1% NaCl, 1.5% agar + Thành phần môi trƣờng BMGY: 1% cao nấm men, 2% peptone, 1.34% yeast nitrogen base, 4x10-5 biotin, 1% glycerol, pH 6.0
+ Môi trƣờng MM: 10%YNB; 1% methanol; 1.10-5% biotin
+ Môi trƣờng MD: 1,34 % YNB; 4.10-5% biotin; 2% glucose
Các hóa chất trên và một số hóa chất khác đều có độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử.
- Dụng cụ:
+ Bộ pipetman 10, 20, 200, 1000 µl và đầu tip tƣơng ứng. Các ống eppendorf 0.2ml và 1.5ml, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, bình tam giác, cốc thủy tinh, ống falcon
- Thiết bị
Bộ điện di đứng (Biorad), máy chuyển màng khô (Biorad), máy ly tâm lạnh 5417 R (Eppendorf), máy PCR gradient của hãng Kyratec, thiết bị điện di ngang và hệ thống chụp ảnh điện di Geldox (Biorad), tủ an toàn sinh học cấp II (Labtech).
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng kỹ thuật PCR
Nguyên lý phản ứng PCR:
PCR là quá trình khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzym DNA polymerase cùng với sự có mặt của mồi và nguyên liệu dNTPs. Sự khuếch đại này đƣợc thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại (25-40
lần) gồm biến tính DNA tại 95oC (DNA sợi đôi thành sợi đơn), hạ nhiệt xuống 37–
65oC (mồi bắt cặp với sợi đơn tƣơng ứng) và kéo dài chuỗi ở khoảng 72oC (tổng
hợp chuỗi DNA). Nhờ vậy, 1 phân tử DNA sợi đôi, sau n chu kỳ phản ứng, sẽ thành 2n phận tử.
Trong nghiên cứu này, để thuận lợi cho bƣớc chèn đoạn gen vào vị trí vùng tạo dịng cũng nhƣ biểu hiện gen nên mồi cho phản ứng PCR đƣợc thiết kế có thêm trình tự nhận biết của các enzym giới hạn và trình tự qui định các axit amin đặc hiệu (tag để sử dụng cho bƣớc tinh sạch). Ngoài ra, dựa theo một số nghiên cứu của các tác giả, trong qúa trình biểu hiện, protease HIV-1 sẽ cắt protein gag - pol tại những vị trí đặc hiệu và giải phóng ra dạng protease có hoạt tính [18; 46]. Hơn nữa, sự mở đầu bằng axit amin Prolin (P) tại đầu N của protease HIV-1 có vai trị rất quan trọng trong hình thành cấu trúc homodimer và quyết định hoạt tính của protease HIV-1. Một số nghiên cứu cũng đã biểu hiện protease HIV-1 thành công khi chèn thêm trình tự tự cắt của enzym tại đầu N [3]. Vì thế, chúng tơi kế thừa kết quả trƣớc, cũng chèn thêm trình tự tự cắt trên mồi. Trình tự tự cắt đƣợc chọn là 18 nucleotide TTCGTATCCTTTAACTTC mã hóa cho 6 axit amin FVSFNF ở đầu C của protein gag. Khi protease đƣợc tạo ra nếu có hoạt tính tự cắt thì sẽ giải phóng ra dạng protease mở đầu bằng Pro. Trình tự các mồi cũng nhƣ mục đích sử dụng trong nghiên cứu đƣợc trình bày ở bảng 2.
Bảng 2. Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR Tên Trình tự Mục đích Tên Trình tự Mục đích Cặp mồi 1 Prot-F1 (44 bp) 5’GACTGAATTCGTATCCTTTAACTTC
CCTCAGATCACTCTTTGGC-3’ (EcoRI) Nhân bản gen mã hóa protease HIV-1 từ