Thành phần Thể tích (µl)
Đệm nHOT Taq DNA polymerase 10X 2,5
dNTPs 2 mM 2,5
Mồi xuôi 1
Mồi ngƣợc 1
DNA khuôn (15 ng/µl) 1
nHOT-Taq DNA polymerase 1
Nƣớc khử ion khử trùng 16
Tổng 25
- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản gen mã hóa protease HIV-1 từ plasmid pCR2.1: - 94oC – 4 phút - 95oC – 30 giây - 50 - 57oC – 1 phút 35 chu kỳ - 72oC – 30 giây - 72oC – 7 phút - Giữ ở 4oC
Sản phẩm của phản ứng PCR sau đó đƣợc kiểm tra trên gel agarose 0,8% - 1,2%. Sau khi kiểm tra sự nhân lên đặc hiệu đoạn gen với kích thƣớc mong muốn, sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch sử dụng Kit tinh sạch PCR của Bioneer.
2.2.2. Điện di DNA trên gel agarose
Nguyên lý điện di DNA
Các phân tử DNA (tích điện âm) dƣới tác dụng của điện trƣờng sẽ di chuyển trong gel từ cực âm sang cực dƣơng. Tốc độ di chuyển trên mạng lƣới gel trong điện trƣờng của DNA phụ thuộc vào kích thƣớc, điện tích, mức độ cuộn xoắn, cấu trúc phân tử. Đoạn DNA có kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm hơn đoạn DNA có
kích thƣớc nhỏ hơn và sẽ tách biệt nhau trong quá trình chạy.
Quy trình điện di:
- Chuẩn bị gel agarose 1%: hòa tan 1 gram agarose vào 100ml dung dịch
TBE 1X, đun sôi cho dung dịch tan hoàn toàn. Để nhiệt độ xuống khoảng 50 – 600
C, đổ dung dịch agarose vào khay điện di, cài lƣợc thích hợp. Sau 20- 40 phút, khi gel đã đông cứng, gỡ lƣợc ra và đặt vào bể điện di, đổ đệm TBE 1X ngập gel, cách mặt gel khoảng 0,5 cm.
- Mẫu DNA đƣợc trộn với loading dye (đã pha với ethidium bromide) theo tỷ lệ mẫu và loading dye là 5:1, mẫu đƣợc tra vào các giếng trên gel. Chạy điện di với hiệu điện thế thích hợp ở 100 V trong 30 phút.
- Quan sát và chụp ảnh trên máy Bio- Rad với tia UV có bƣớc sóng 320nm.
2.2.3. Gắn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện
2.2.3.1. Cắt mở vòng vector và sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc kiểm tra sự nhân lên chính xác sẽ đƣợc xử lý với cặp enzym giới hạn có trình tự cắt đặc hiệu đã thiết kế trên cặp mồi số 1 (Bảng 2) để tạo các đầu tƣơng thích ở hai đầu đoạn gen. Đồng thời vector biểu hiện pPIC9 đƣợc xử lý cùng bằng cặp enzym giới hạn với sản phẩm PCR để tạo đầu tƣơng thích tƣơng ứng và cố định chiều của đoạn DNA đƣa vào vector biểu hiện. Thành phần phản ứng cắt bằng enzym giới hạn với 20 µl tổng thể tích (bảng 4).