CHƯƠNG 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Xác định hàm lượng D-xylose có trong arabinoxylan sau kh
phân bằng D-xylose kit [60].
Nguyên tắc:
- Sự chuyển đổi qua lại các cấu hình dạng α- và β của D-xylose được xúc tác bởi enzyme xylose mutarotase (XMR)
α-D-Xylose → β-D-xylose - β-D-xylose bị oxi hóa bởi NAD+
thành acid D-xylonic khi có sự hiện diện của β-xylose dehydrogenase (β-XDH) tại pH 7,5
β-D-Xylose + NAD+
→ acid D-xylonic + NADH + H+
Hàm lượng NADH tạo thành tỷ lệ với hàm lượng xylose tổng số có trong mẫu. Trong đó, hàm lượng NADH tạo thành được đo bằng sự tăng hấp thụ ở bước sóng 340 nm, từ đó tính tốn được hàm lượng xylose tương ứng có trong mẫu tham gia phản ứng.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
Quy trình:
Thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.1:
Bảng 2.1: Thành phần của phản ứng định lượng D-xylose bằng D-XYLOSE KIT
Thể tích hút Dung dịch Blank Dung dịch mẫu Nước cất(ở 25°C)
Mẫu
Dung dịch I ( đệm TE) Dung dịch II (NAD+/ATP) Dung dịch III (hexokinase)
400 µl 20 µl nước cất 80 µl 80 µl 4 µl 400 µl 20 µl 80 µl 80 µl 4 µl
Trộn đều, đo A340 của dung dich (A1) sau ít nhất 5 phút và bắt đầu phản ứng khi thêm:
Dung dịch IV (XDH/XMR) 10 µl 10 µl
Trộn đều, đo giá trị A340 của dung dịch (A2) khi kết thúc phản ứng (6 phút)
Sản phẩm phản ứng được đo ở bước sóng 340 nm. Thể tích phản ứng cuối cùng: 594 µl, đối chứng dương là D- xylose có nồng độ 0,25 mg/ml, thể tích mẫu và nước có thể thay đổi nhiều hơn hoặc ít hơn tùy thuộc vào nồng độ của mẫu cần phân tích
Hàm lượng D-xylose được tính tốn như sau: C = x ΔAxylose (g/L ) Trong đó
V = thể tích cuối cùng (ml)
MW = khối lượng phân tử của D-xylose (g/mol) ε = Hệ số hấp thụ quang của NADH tại 340 nm
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
= 6300 (l x mol-1 x cm-1) d = Độ dày cuvet (cm) v = thể tích mẫu (mL) Do đó, với thể tích mẫu là 20 µl:
Cxylose = x ΔAxylose = 0,7076 x ΔAD-xylose Ta có:
ΔA xylose của Arabinoxylan = ΔAxylose tổng – ΔAxylose tự do = ΔAxylose của D2 – ΔAxylose = ΔAD* Cxylose của arabinoxylan (g/L) = 0,7076× ΔAD* x hệ số pha lỗng (nếu có)
C D-xylose của arabinoxylan (g/100g) = Cxylose của arabinoxylan (g/L)x100/trọng lượng mẫu (g/L)
2.2.2.2. Xác định hàm lượng L-arabinose có trong arabinoxylan sau khi đươc thủy phân bằng Arabinan kit [59]
Nguyên tắc:
- Sự chuyển đổi qua lại các cấu hình dạng α- và β của L- arabinose được xúc tác bởi enzyme galactose mutarotase (GalMR)
α -L-Arabinose → β -L-arabinose - β-L-arabinose bị oxi hóa bởi NAD+
thành acid D-arabinonic khi có sự hiện diện của enzyme β -galactose dehydrogenase (β- GalDH).
β -L-Arabinose + NAD+ → acid L-arabinonic + NADH + H+
Hàm lượng NADH tạo thành tỷ lệ với hàm lượng arabinose tổng số có trong mẫu và được xác định thông qua giá trị A340.
Quy trình:
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngơ Thị Huyền Trang
Bảng 2.2: Thành phần của phản ứng định lượng L-arabinose bằng ARABINAN KIT
Thể tích hút Dung dịch Blank Dung dịch mẫu Nước cất (ở 25°C) Mẫu Đệm B (đệm acetate, pH 4.0) Dung dịch 1 (Đệm Tris-HCl) Dung dịch 2 (NAD+) 404 µl 20 µl nước cất 20 µl 40 µl 20 µl 404 µl 20 µl 20 µl 40 µl 20 µl
Trộn đều, đo A340 của dung dich (A1) sau ít nhất 3 phút và bắt đầu phản ứng khi thêm:
Dung dịch 4 (β-GalDH + Gal-MR) 4 µl 4 µl
Trộn đều, ủ 40°C trong 10 phút. Đo A340 của dung dịch (A2) khi kết thúc phản ứng.
Sản phẩm phản ứng được đo ở bước sóng: 340 nm. Thể tích phản ứng cuối cùng là 508 µl, đối chứng dương là arabinose có nồng độ 0,5 mg/ml, thể tích mẫu và thể tích nước có thể thay đổi nhiều hơn hoặc ít hơn tùy thuộc vào nồng độ của mẫu cần phân tích.
Hàm lượng L-arabinose được tính tốn như sau: C = x ΔAarabinose (g/L ) Trong đó
V = thể tích cuối cùng (ml)
MW = khối lượng phân tử của L-arabinose (g/mol) ε = Hệ số hấp thụ quang của NADH tại 340 nm = 6300 (l x mol-1 x cm-1)
d = Độ dày cuvet (cm) v = Thể tích mẫu (mL)
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
ΔA arabinose của Arabinoxylan = ΔAarabinose tổng số – ΔAarabinose tự do = ΔA* Do đó, với thể tích mẫu là 20 μl, ta có:
Carabinose = (0,508 x 150,1 x ΔA arabinose) / (6300 x 1 x 0,02) (g/L) = 0,6052 x ΔA (g/L) và nhân với hệ số pha lỗng (nếu có)