CHƯƠNG 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.3. Phân tích định tính arabinoxylan bằng phương pháp sắc ký bản mỏng
Nguyên tắc :
Sắc ký bản mỏng bao gồm lớp gel mỏng tráng trên bề mặt kính hoặc nhơm, là pha cố định và hệ thống dung môi hay pha chuyển động được lựa chọn để tạo ra sự phân tách các chất chấm trên bản gel. Do các chất di chuyển với tốc độ nhanh chậm khác nhau nên chúng dần dần được tách ra khỏi nhau dưới dạng các vết trên bản mỏng. Để đánh giá khả năng phân tách của từng chất trên bản sắc ký người ta quan tâm đến giá trị Rf đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất trong hệ thống sắc ký, được tính bằng tỉ số giữa khoảng cách mà chất đó di chuyển được khỏi vệt xuất phát trên khoảng cách mà dung môi di chuyển được.
Rf = Trong đó:
a: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử
b: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến vạch mức cuối cùng mà dung môi chạy đến Kết quả phân tách các chất trên bản sắc ký có thể được hiển thị bằng các phản ứng màu đặc trưng kèm theo việc so sánh với chất chuẩn. Khi việc phân tách các chất trong hỗn hợp khơng rõ ràng, người ta có thể thay đổi thành phần và/ hoặc tỷ lệ của các dung môi trong hỗn hợp dung môi sắc ký. Việc bổ sung các chất không phân cực cũng như tăng tỷ lệ của chúng sẽ tạo điều kiện cho các chất ít phân cực chạy nhanh hơn khỏi vạch xuất phát và ngược lại [1].
Quy trình:
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
chấm mẫu được đặt vào hệ thống bình sắc ký có nắp đậy, trong đó có chứa dung môi hữu cơ. Mức dung môi luôn được giữ thấp hơn vạch xuất phát của mẫu. Dung môi sẽ theo lớp gel để chạy ngược lên và mang theo các chất cần phân tích. Khi vạch dung mơi chạy đến gần mép trên của bản gel sắc ký thì phải làm ngừng quá trình sắc ký. Bản gel được lấy ra, làm khơ dung mơi và sau đó có thể cho chạy lại một vài lần tương tự, tùy thuộc vào sự tách bạch giữa các mẫu quan tâm [1]. Kết quả phân tách các chất trên bản sắc ký được hiển thị bằng phản ứng màu đặc trưng kèm theo việc so sánh với chất chuẩn là D-xylose và L-arabinose được mua từ hãng Megazyme.
2.2.4. Tinh sạch và cơ đặc mẫu bằng màng lọc có kích thước lỗ xác định
Nguyên tắc:
Màng lọc được cấu tạo dựa trên mạng lưới các polymer được liên kết chéo tạo thành các lỗ. Các chất hịa tan có kích thước nhỏ sẽ di chuyển một chiều qua các lỗ trên màng từ dung dịch có nồng độ cao đến dung dịch có nồng độ thấp cho đến khi nồng độ cân bằng ở hai dung dịch. Vì thế sử dụng màng lọc có thể phân tách các chất hịa tan trong dung dịch dựa trên kích thước hoặc khối lượng phân tử [62].
Quy trình:
Arabinoxylan dạng dịch lỏng được cho vào túi thẩm tích với màng lọc có kích thước lỗ xác định, túi mẫu sau đó được cho vào cốc chứa nước cất đã được khử trùng, được đặt lên máy khuấy từ và thẩm tích trong 1 ngày ở 4oC để loại muối và các chất phân tử nhỏ khác. Mẫu trong túi sau đó được cơ đặc bằng cách cho bay hơi nước ở 4o
C trong 1 ngày và thu lấy mẫu trong túi bảo quản ở -20oC .
2.2.5. Đánh giá tỷ lệ và kích thước của arabinoxylan bằng phương pháp sắc ký lọc gel lọc gel
Nguyên tắc:
Sắc ký lọc gel bao gồm pha cố định là một loại gel có cấu tạo dạng mạng lưới hay lỗ và kích thước của các lỗ rây này khác nhau tùy theo loại gel được sử
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngơ Thị Huyền Trang
dụng, cịn pha chuyển động là một loại dung dịch đệm hay dung mơi thích hợp. Các chất khi đi qua hệ thống lọc gel sẽ được phân tách theo nguyên tắc, trong đó chất có kích thước lớn ra trước, tiếp đến là chất có kích thước vừa và cuối cùng là chất có kích thước nhỏ, là do chất có kích thước lớn khơng thể chui vào các hệ thống lỗ gel, do đó khi đi qua phần kẽ hở giữa các hạt gel và ra nhanh hơn, các chất có kích thước vừa sẽ có cơ hội chui vào các lỗ gel và do đó mất nhiều thời gian để chui ra. Các chất có kích thước nhỏ dễ dàng chui vào lỗ gel và cơ hội chui vào các lỗ gel cao nhất và thời gian đi qua hệ thống lọc gel lâu nhất nên được đẩy ra khỏi hệ thống gel muộn nhất [1].
Dựa vào sắc ký lọc gel có thể đánh giá khối lượng phân tử tương đối của chất với nguyên tắc: Logarit KLPT (logMw) của các chất tỷ lệ nghịch với hệ số Ve/Vo, trong đó Ve là thể tích rửa chiết của chất sắc ký, Vo là thể tích trống của cột. Khi có được một loạt các chất chuẩn với KLPT đã biết, người ta cho sắc ký qua cột để tính ra giá trị Ve/Vo và lập đồ thị tương quan giữa logMw và Ve/Vo, từ đó với một chất chưa biết KLPT nhưng biết được Ve khi đi qua cột thì có thể tính được KLPT của chất đó [1] một cách tương đối.
Quy trình:
Gel đã trương nở được nhồi vào cột 1x 60 cm. Cột gel được cân bằng với nước cất với thể tích tổi thiểu bằng 2 lần thể tích cột gel để tạo môi trường gel sắc ký đồng nhất trong toàn bộ cột gel. Dextran xanh (2.000 kDa) được dùng để tính thể tích trống Vo của cột. Sau khi cột gel được rửa sạch, từng dịch protein chuẩn được nạp vào cột từ từ, đảm bảo bề mặt gel ổn định. Sau đó cho đệm chảy qua liên tục, tốc độ dòng chảy đươc duy trì khoảng 20 ml/giờ, thu các phân đoạn vào các ống riêng. Xác định hàm lượng protein mỗi phân đoạn để tính Ve của từng protein chuẩn với cách tinh giống như tính Vo. Tính tốn các giá trị logMw và Ve/Vo của các chất chuẩn. Sau đó lập đồ thị tương quan giữa logMw và Ve/Vo với trục tung là giá trị logMw và trục hoành là tỷ lệ Ve/Vo.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
Mẫu đã cô đặc được nạp vào cột với thể tích khoảng 1 ml với cách thức tiến hành tương tự như đối với protein chuẩn. Khi bắt đầu cho mẫu lên cột thì cũng bắt đầu tính thể tích mẫu chảy qua cột bằng cách tiến hành thu các phân đoạn vào từng ống riêng. Các phân đoạn rửa chiết sau đó được xác định hàm lượng arabinoxylan thơng qua hàm lượng xylose và arabinose như quy trình được trình bày ở mục 2.2.2. Biểu đồ của quá trình phân tách qua sắc ký lọc gel được thiết lập với trục tung là giá trị độ hấp thụ ở 340 nm và trục hồnh là các phân đoạn/thể tích rửa chiết.
Dựa trên giá trị Ve của các đỉnh sắc ký qua cột lọc gel của chế phẩm arabinoxylan sau khi qua cột, tỷ lệ Ve/Vo của từng phân đoạn đỉnh sắc ký được tính và giá trị Ve/Vo được đối chiếu này với đồ thị tương quan của các chất chuẩn sẽ suy ra được giá trị logMw của AX ở phân đoạn đấy, từ đó có được giá trị KLPT tương ứng một cách tương đối.
2.2.6. Xác định độ ẩm
Nguyên tắc:
Độ ẩm được xác định theo phương pháp sấy khô mẫu ở 105oC để làm bay hơi hết hơi nước trong mẫu đến khối lượng không đổi. Mẫu được cân khối lượng trước và sau khi sấy khơ, từ đó tính ra phần trăm nước có trong mẫu.
Quy trình:
Hộp nhơm dùng để đựng mẫu được sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC đến khối lượng không đổi, dùng cân phân tích cân xác định trọng lượng của hộp cân mo (g). Sau đó cho mẫu vào hộp nhơm, đem cân phân tích, ghi nhận khối lượng hộp và mẫu là m1 (g). Hộp mẫu được đặt vào tủ sấy đang ở nhiệt độ 105oC, sau 1 ngày thì lấy hộp mẫu ra để nguội, cân và sau đó để hộp vào tủ sấy tiếp, cứ sau 1 ngày thì hộp được cân lại lần nữa cho đến khi khối lượng hộp mẫu giữa các lần sấy khác nhau không quá 0,01%, khối lượng m2 (g) được ghi lại.
Cơng thức tính độ ẩm theo phần trăm:
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngơ Thị Huyền Trang
Trong đó:
mo: Khối lượng hộp sau khi được sấy đến khối lượng không đổi. m1: Khối lượng hộp và mẫu trước khi sấy.
m2: khối lượng hộp và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi.
2.2.7. Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl [2]
Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên cơ sở định lượng nitơ protein, từ đó tính ra lượng protein bằng cách nhân với hệ số 6,25 (dựa trên nguyên tắc trong protein nitơ chiếm 16%). Dưới tác dụng của H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất hữu cơ có chứa nito (N) bị phân hủy và bị oxy hóa đến CO2 và nước, còn nitơ chuyển thành ammoniac và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối ammonium sulfate.
Quá trình được tiến hành theo các bước sau: Vơ cơ hóa ngun liệu:
R-CHNH2-COOH + H2SO4 CO2 + H2O + (NH4)2SO4 Cất đạm
(NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2NH3 ↑ +2 H2O Phản ứng xảy ra trong bình hứng:
NH3+ H2SO4 (NH4)2SO4 + H2SO4 dư (ở bình hứng)
Chuẩn độ H2SO4 dư ở bình hứng bằng NaOH có nồng độ 0,1 N, từ đó tính được hàm lượng đạm có trong mẫu nghiên cứu.
2.2.8. Xác định hàm lượng asen
Nguyên tắc:
Hàm lượng asen có thể được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp so màu với thuốc thử bạc dietyldithiocarbanate (TCVN 5780- 1994), phương pháp dựa trên nguyên tắc cất asin (AsH3) ra khỏi hỗn hợp rồi phản ứng với thuốc thử bạc dietyldithiocacbanat trong pyridine cho sản phẩm có màu đỏ nâu và được so màu ở bước sóng 520 nm [63]; hoặc sử dụng phương pháp đo phổ
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xây dựng quy tr nh định tính và định lượng arabinoxylan
Để xây dựng quy trình phân tích định tính và định lượng arabinoxylan, chúng tôi đã sử dụng arabinoxylan thương mại có nguồn gốc từ bột mì được mua từ hãng Megazyme làm mẫu chuẩn để tối ưu các bước của quy trình định lượng. Sau đó, chúng tơi thử nghiệm quy trình này đối với chế phẩm AX được tạo ra từ cám gạo.
3.1.1. Thủy phân arabinoxylan bằng acid và định tính, định lượng arabinoxylan arabinoxylan
Đối với chế phẩm arabinoxylan cám gạo ở dạng bột: 1 g mẫu được thủy phân bằng acid HCl 1,3 M hoặc acid H2SO4 0,5 M ở 100oC trong thời gian 180 phút, sản phẩm sau khi thủy phân được làm nguội về nhiệt độ phòng và được trung hịa về pH 7,0 bằng NaOH có nồng độ tương đương với nồng độ acid đã sử dụng. Dung dịch sau khi trung hòa được ly tâm loại muối ở 5.000 vòng/phút trong 10 phút trước khi được định lượng D-xylose và L-arabinose bằng kit của Megazyme (mục 2.2.2).
Đối với chế phẩm arabinoxylan ở dạng dịch lỏng: bổ sung HCl đặc (hoặc HCl ở nồng độ cao hơn 1,3 M) hoặc H2SO4 nồng độ 2 M vào 100 μl mẫu để đạt nồng độ cuối cùng của HCl là 1,3 M và H2SO4 là 0,5 M. Dung dịch sau đó cũng được thủy phân ở 100o
C trong 180 phút và trung hòa bằng NaOH giống như quy trình định lượng với mẫu dạng bột. Hàm lượng arabinoxylan được tính bằng tổng hàm lượng xylose và arabinose nhân với hệ số 0,88 [17].
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngơ Thị Huyền Trang
ảng 3.1: Kết quả định lượng D-xylose và L-arabinose sau khi thủy phân arabinoxylan thương mại bằng acid
Acid ∆A340 * D-xylose Nồng độ xylose (mg/ml) Tỷ lệ xylose trong AX (%) ∆A340 * L-arabinose Nồng độ arabinose (mg/ml) Tỷ lệ arabinose trong AX (%) HCl 0,52 0,60 60 0,59 0,360 36,0 H2SO4 0,49 0,56 56 0,49 0,296 29,6
*) Mẫu được đo 3 lần và tính tốn giá trị ∆A340 trung bình
Kết quả định lượng D-xylose và L-arabinose sau khi thủy phân arabinoxylan thương mại bằng acid ở bảng 3.1 cho thấy, arabinoxylan (thương mại) sau khi được thủy phân bằng acid HCl có chứa 60% xylose, 36% arabinose, cịn thủy phân bằng H2SO4 thì chứa 56% xylose và 29,6% arabinose. Tỷ lệ xylose và arabinose thu được phù hợp với một số đặc trưng của AX của bột mì (có thành phần khoảng 62% là đường xylose, còn lại là đường arabinose [59, 60]). Như vậy, hàm lượng AX được xác định bằng cách thủy phân thành các đường đơn xylose và arabinose bằng acid HCl và H2SO4 là 96% và 85,6%, chứng tỏ HCl cho hiệu suất thủy phân tốt hơn H2SO4. Vì thế, chúng tơi đã sử dụng quy trình này để định lượng AX có trong chế phẩm tạo ra từ cám gạo.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
ảng 3.2: Kết quả định lượng D-xylose sau khi thủy phân chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo bằng acid
Phương pháp thủy phân ∆A340 * Nồng độ xylose (mg/ml)
Hàm lượng xylose (mg/g mẫu)
HCl 0,52 1,68 8,40
H2SO4 0,29 1,64 8,21
*) Mẫu được đo 3 lần và tính tốn giá trị ∆A340 trung bình
ảng 3.3: Kết quả định lượng L-arabinose sau khi thủy phân chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo bằng acid
Phương pháp thủy phân ∆A 340* Nồng độ arabinose (mg/ml) Hàm lượng arabinose (mg/g mẫu) HCl 0,63 1,73 8,65 H2SO4 0,29 1,40 7,02
*) Mẫu được đo 3 lần và tính tốn giá trị ∆A340 trung bình
Kết quả định lượng D-xylose và L-arabinose trong chế phẩm AX tạo ra từ cám gạo (bảng 3.2 và 3.3) cho thấy hàm lượng xylose và arabinose trong 1g chế phẩm AX được thủy phân bằng HCl cao hơn so với được thủy phân bằng H2SO4.
Do mỗi đơn phân xylose, arabinose có khối lượng phân tử là 152 Da, khi liên kết với nhau hình thành cấu trúc AX thì bị loại đi một phân tử nước (18 Da), vì vậy để xác định hàm lượng AX khi đã biết hàm lượng của các đường đơn xylose và arabinose, chúng tôi sử dụng hệ số 0,88 (134/152 = 0,88). Kết quả chúng tôi thu được hàm lượng của AX theo phương pháp thủy phân bằng HCl và H2SO4 tương ứng là 15 mg/g mẫu và 13,4 mg/g mẫu (bảng 3.4).
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngơ Thị Huyền Trang
Bảng 3.4: Hàm lượng arabinoxylan có mặt trong chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo Phương pháp thủy phân Hàm lượng xylose (mg/g mẫu) Hàm lượng arabinose (mg/g mẫu) Hàm lượng AX (mg/g mẫu)* HCl 8,40 8,65 15,0 H2SO4 8,21 7,02 13,4
(*): Hàm lượng arabinoxylan được tính bằng tổng lượng xylose và arabinose nhân với hệ số 0,88
Như vậy, hàm lượng AX được xác định theo phương pháp thủy phân bằng acid HCl cao hơn so với thủy phân bằng H2SO4,nhưvậy, chứng tỏ hiệu suất thủy phân AX bằng HCl là tốt hơn.
Để khẳng định thêm sự có mặt của D-xylose và L-arabinose trong chế phẩm AX sau khi được thủy phân bằng acid, chúng tôi tiến hành phân tích các sản phẩm sau khi thủy phân bằng phương pháp sắc ký bản mỏng trên gel silica.
Các mẫu sau khi được thủy phân bằng acid được trung hòa về pH 7,0 bằng dung dịch NaOH 1,3M hoặc NaOH 0,5 M (tùy thuộc vào acid sử dụng để thủy phân AX là HCl 1,3 M hay H2SO4 0,5 M), sau đó được làm khơ và hịa tan trở lại trong methanol 100%, và được chấm lên bản sắc ký (thể tích mỗi mẫu chấm 10-20 µl), sử dụng hệ dung môi n-butanol : acid axetic : H2O (tỷ lệ 3:1:1). Bản sắc ký sau đó được làm khơ và được chạy thêm một lần nữa trước khi được nhuộm màu bằng dung dịch aniline phthalate, hiện màu ở 100oC trong 10 phút và quan sát kết quả.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Ngô Thị Huyền Trang
1 2 3 4 5
Hình 3.1: Kết quả sắc ký bản mỏng chế phẩm chứa arabinoxylan từ cám gạo sau khi được thủy phân bằng acid
Đường chạy 1: Đường chuẩn D-xylose Đường chạy 2: Đường chuẩn L-arabinose
Đường chạy 3: Chế phẩm được thủy phân bằng acid HCl Đường chạy 4: Chế phẩm được thủy phân bằng acid H2SO4 Đường chạy 5: Chế phẩm chưa thủy phân
Kết quả sắc ký bản mỏng sản phẩm thủy phân AX (hình 3.1) cho thấy chế