CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.4. Các phƣơng pháp chuẩn bị mẫu cho phân tích thuốc trừ sâu photpho hữu cơ
Mục đích của các phƣơng pháp chuẩn bị mẫu cho phân tích là làm sao để tách chiết đƣợc tồn bộ chất cần phân tích (TTS photpho hữu cơ) ra khỏi đối tƣợng mẫu phân tích (nền mẫu). Có nhiều phƣơng pháp chiết TTS photpho hữu cơ nhƣ: Chiết rắn lỏng SLE (solid- liquid extraction, chiết lỏng – lỏng LLE (liquid – liquid extraction), chiết pha rắn SPE (solid phase extraction), vi chiết pha rắn SPME (solid phase microextraction), chiết lỏng siêu tới hạn SFE, chiết lỏng siêu tới hạn SFE, chiết lỏng có hỗ trợ áp suất (PLE), chiết bằng bộ kít QuEChERS…
Đối với mẫu mơi trƣờng hoặc mẫu thực phẩm ở dạng rắn thì việc dùng dung môi và hỗ trợ bằng kỹ thuật lắc khuấy trộn hoặc vi sóng là thích hợp. Trong các quy trình thì đều cần làm sạch bằng chiết pha rắn hoặc chiết lỏng – lỏng để loại bớt tạp chất bẩn từ nền mẫu.
1.4.1. Phương pháp chiết lỏng - lỏng
Nguyên tắc: Chiết lỏng lỏng dựa trên sự phân bố của chất phân tích giữa
hai pha lỏng, sử dụng dung môi hữu cơ để chiết đối tƣợng phân tích tan trong dung môi ở nhiệt độ thƣờng những mẫu đã làm nhỏ. Hiệu quả của việc chiết lỏng lỏng phụ thuộc vào ái lực của chất phân tích với dung môi chiết, tỉ lệ thể tích mỗi pha [16]. Có thể dùng thêm một số tác nhân bổ trợ nhƣ: lắc cơ học, khuấy trộn siêu tốc, sóng siêu âm.
Điều kiện chiết: Để có đƣợc kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện và đảm bảo các yêu cầu nhất định sau đây:
- Dung môi chiết phải tinh khiết cao để không làm nhiễm bẩn thêm các chất phân tích vào mẫu;
- Dung mơi chiết phải hịa tan tốt các chất phân tích, nhƣng lại khơng hịa tan tốt các chất khác có trong mẫu;
- Hệ số phân bố của hệ chiết phải lớn, để cho sự chiết đƣợc triệt để; - Chiết nhanh đạt cân bằng và thuận nghịch, để giải chiết tốt;
- Phải chọn mơi trƣờng axit, pH thích hợp;
- Thực hiện chiết trong nhiệt độ phù hợp và giữ khơng đổi trong cả q trình - Phải lắc hoặc trộn đều mạnh để q trình chiết xảy ra tốt.
Phân loại: Có hai kiểu chiết là chiết tĩnh và chiết dòng chảy liên tục. Trong
phân tích, kiểu tĩnh đƣợc ứng dụng nhiều hơn do nó đơn giản và dễ thực hiện.
- Phương pháp chiết tĩnh: Là phƣơng pháp đơn giản, không cần máy móc phức tạp, chỉ cần một số phễu chiết (dung tích 100 ml, 250 ml, 500 ml) là có thể tiến hành đƣợc ở mọi phịng thí nghiệm (xem Hình 1.2). Việc lắc chiết có thể thực hiện bằng tay hay bằng máy lắc nhỏ, nên việc chiết đƣợc thực hiện dễ dàng và dễ đồng nhất.
- Phương pháp chiết dòng chảy liên tục: Trong phƣơng pháp này khi chiết hai pha lỏng không trộn đƣợc vào nhau (hai dung mơi, trong đó 1 dung mơi chứa chất phân tích) đƣợc bơm liên tục và đi ngƣợc chiều nhau với tốc độ nhất định trong hệ chiết, nhƣ phễu chiết hay bình chiết liên hồn đóng kin khi để tiếp xúc với nhau. Hoặc cũng có thể chỉ một pha dung mơi chuyển động, 1 pha đứng n. Khi đó chất phân tích sẽ đƣợc phân bố vào hai dung mơi theo tính chất của chúng để đạt đến trạng thái cân bằng. Chiết theo cách này hiệu quả chiết cao. Đây là phƣơng pháp chiết đƣợc ứng dụng trong sản xuất công nghệ.
Để thực hiện cách chiết này, phải có hệ thống máy chiết, cột chiết hay bình chiết, có bơm để bơm các chất theo dòng chảy ngƣợc chiều nhau với tốc độ nhất định thích hợp, hoặc chỉ một chất hay cả hai chất chuyển động ngƣợc chiểu nhau, và phải có bộ tách pha, để tách các chất ngay trong quá trình chiết để lấy chất đƣợc chiết ra liên tục, hay theo từng thời điểm (chu kỳ) nhất định mà cân bằng chiết đạt đƣợc.
Ứng dụng và ưu nhược điểm
Ứng dụng: Phƣơng pháp chiết tĩnh đơn giản, dễ thực hiện, đã và đang đƣợc
ứng dụng phổ biến, hiệu quả trong lĩnh vực tách chiết chất phân tích và làm giàu các chất phân tích phục vụ cho việc xác định hàm lƣợng vết các kim loại, các chất hữu cơ, HCBVTV độc hại trong các mẫu nƣớc, nƣớc thải, nƣớc biển… Ngoài ra, sự kết hợp của dung môi và pH làm tăng khả năng chiết nhiều TTS từ nền mẫu, kỹ thuật đơn giản, ít tốn kém. Chiết lỏng lỏng thƣờng đƣợc sử dụng để chiết TTS từ mẫu
nƣớc trong môi trƣờng, hexan và cyclohexan là dung môi thƣờng dùng để chiết các chất không phân cực nhƣ TTS clo hữu cơ, photpho hữu cơ. Đicloromethane, chloroform là dung môi để chiết các chất phân cực vừa.
Ưu điểm:
- Dùng đƣợc cho cả chiết phân tích và sản xuất tách chiết lƣợng lớn; - Lấy riêng chất phân tích, loại đƣợc các chất ảnh hƣởng, nhất là nền mẫu; - Thích hợp làm giàu lƣợng lƣợng nhỏ chất phân tích;
- Sản phẩm chiết phù hợp đƣợc cho nhiều phƣơng pháp phân tích.
Nhược điểm: Sử dụng dung mơi hữu cơ, ít nhiều gây ảnh hƣởng đến môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời.
Hình 1.2. Mơ hình chiết lỏng – lỏng
Các tác giả Hung Tse, Michael Comba, Mehran Alaee [36] đã tiến hành
chiết 13 hợp chất TTS photpho hữu cơ trong mẫu nƣớc bằng phƣơng pháp chiết lỏng lỏng. 500 ml nƣớc thêm chuẩn photpho hữu cơ (100 µl trong axeton), để cân bằng ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Mẫu đƣợc chiết với 100 ml dung môi dicloromethane đƣợc chia làm 3 lần chiết và đƣợc làm khô bằng Na2SO4 khan. Dịch chiết sau khi thêm 5 ml isooctane thì đƣợc cơ đặc tới 3 ml bằng thiết bị cô quay. Mẫu đƣợc chuyển sang ống ly tâm (15 ml) và rửa bằng 2 ml hexan, sau đó đem bay hơi bằng dịng khí nitơ đến thể tích 1 ml, cuối cùng đem định lƣợng trên GC-NPD và GC-ECD. Hiệu suất thu hồi trong mẫu nƣớc nằm trong khoảng 76-102%, giới hạn phát hiện 0,003-0,29 µg/l đối với mẫu nƣớc tự nhiên.
Các tác giả Jalal Hassan, Masoumeh Sarkouhi [38] đã tiến hành chiết hai
TTS photpho hữu cơ là diazinon và malathion ra khỏi mẫu nƣớc bằng phƣơng pháp
Dung môi nƣớc Dung môi
hữu cơ
Thêm dung môi sạch không trộn lận với pha nƣớc Lắc hoặc khuấy để các phân tử phân vùng Lắng và phân tách các pha
chiết lỏng-lỏng. Mẫu đƣợc chiết với methanol chứa butyl acetate là dung mơi có tỷ trọng thấp hơn so với nƣớc. Sau giai đoạn chiết, mẫu đƣợc cô đặc và tiêm vào thiết
bị phân tích GC-FID, khoảng tuyến tính thu đƣợc là 0,4-1000 µg/l với R2 = 0,997÷0,999. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 0,1 µg/l.
1.4.2. Phương pháp chiết rắn - lỏng SLE (solid - liquid extraction)
Nguyên tắc: Phƣơng pháp chiết rắn - lỏng đƣợc sử dụng để chiết tách các
chất hữu cơ (TTS) trong nền mẫu rắn để phân tích. Đầu tiên dung mơi chiết len lỏi sâu vào giữa các hợp phần mẫu để tiếp xúc với chất phân tích, sau đó chất phân tích khuếch tán đi vào dung môi chiết. Yếu tố quan trọng nhất của kỹ thuật chiết rắn lỏng này là lựa chọn dung mơi thích hợp. Tuy nhiên, những yếu tố khác nhƣ áp suất, nhiệt độ cũng có ảnh hƣởng quan trọng lên hiệu quả chiết. Khi tăng áp suất sẽ làm tăng khả năng phân tán của dung môi đi sâu vào nền mẫu rắn, tăng nhiệt độ sẽ làm tăng khả năng hòa tan của các chất phân tích vào dung môi. Trong phƣơng pháp chiết rắn – lỏng có 4 kỹ thuật chiết khác nhau đó là: Lắc, chiết soxhlet, chiết siêu âm và chiết vi sóng.
1.4.2.1. Chiết rắn –lỏng bằng ỹ thuật lắc
Là cách đơn giản và thuận tiện thƣờng sử dụng chiết TTS từ trái cây và rau quả. Chỉ cần cho dung mơi thích hợp rồi lắc trong khoảng thời gian xác định. Dung môi thƣờng sử dụng là axeton và acetonitrile vì khả năng trộn với nƣớc kéo chất phân tích từ nền mẫu ra dung dịch lỏng, ngoài ra điclometan hay hexan cũng đƣợc dùng cho những hợp chất TTS kém phân cực.
Kỹ thuật lắc với dung môi đơn giản nhƣng không hiệu quả trong trƣờng hợp chất phân tích có liên kết chặt chẽ với nền mẫu. Trong trƣờng hợp này, chiết siêu âm là cách hỗ trợ tốt, giúp cho sự khuếch tán của dung môi vào mẫu, tăng thêm sự tiếp xúc để quá trình chiết hiệu quả hơn.
1.4.2.2. Chiết rắn –lỏng bằng ỹ thuật siêu âm
Nguyên tắc: Chiết siêu âm là việc loại bỏ và thu hồi các chất phân tích hữu
cơ từ nền mẫu rắn bằng dung môi đƣợc khuếch tán bằng năng lƣợng âm thanh ở tần số vƣợt quá âm thanh mà tai ngƣời có thể nghe (xem Hình 1.3). Năng lƣợng siêu âm
đủ mạnh để phá vỡ và tán nhỏ nền mẫu, do đó làm tăng khả năng hịa tan chất phân tích vào dung mơi.
Ứng dụng và ưu nhược điểm
Ứng dụng: dùng để chiết các hợp chất hữu cơ không bay hơi và dễ bay hơi
trong các mẫu dạng rắn nhƣ đất, bùn, chất thải rắn.
Ưu điểm : Kỹ thuật chiết siêu âm có thể giảm đƣợc thời gian và lƣợng dung môi
sử dụng, do đó tốc độ chiết nhanh (10-45 phút) và chiết an tồn hơn, bởi vì do kỹ thuật này sử dụng nhiệt độ thấp, tránh đƣợc sự bay hơi của dung mơi và chất phân tích có nhiệt độ sơi thấp, đồng thời cịn duy trì đƣợc các hoạt chất sinh học. Siêu âm tần số cao tăng khả năng xâm nhập của dung mơi, tăng khả năng kết dính và hiệu quả chiết cao. Ngoài ra chiết siêu âm không phụ thuộc vào nền mẫu, thiết bị chiết rẻ tiền.
Nhược điểm: Quá trình chiết gây ồn, nhất thiết phải qua quá trình lọc mẫu
làm dung mơi có thể bay hơi ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời.
Các tác giả Consuelo Sanschez- Brunete, Beatriz Albero và Jose L. Tadeo
[30] đã tiến hành chiết TTS photpho hữu cơ ra khỏi nền mẫu đất bằng chiết siêu âm. 5g mẫu đất đƣợc trộn với 2g Na2SO4 khan, đem chiết siêu âm 2 lần, mỗi lần với 5ml dung môi etylaxetat, siêu âm trong 5 phút. Dịch chiết đƣợc lọc ra, mẫu đất đƣợc tráng rửa bằng 1ml dung mơi etyl axetat, sau đó đem bay hơi, cơ cạn về 1ml và định lƣợng bằng GC-MS. Độ thu hồi nằm trong khoảng 87- 106,2% với độ lệch chuẩn tƣơng đối là 2,4-10,6%. Khoảng tuyến tính xây dựng đƣợc là 25-1000 µg/L, R2 > 0,999 với giới hạn phát hiện LOD = 0,02-1,6 µg/kg.
Các tác giả Ana Isabel García-Valcárcel, José Luis Tadeo [28] đã tiến
hành chiết các hợp chất photpho hữu cơ trong bùn thải bằng kỹ thuật chiết siêu âm với các dung môi chiết khác nhau (acetoneitrile, ethyl acetate và methanol), sau đó mẫu đƣợc định lƣợng bằng LC-MS/MS. Nghiên cứu chỉ ra rằng chiết với dung mơi
acetonitrile có chứa axit acetic 1% cho kết quả tốt nhất với độ thu hồi là 83,2÷106,4%; RSD ≤ 8,7%; LOD = 1-14 ng/g.
1.4.2.3. Chiết rắn –lỏng bằng ỹ thuật Soxhlet
Nguyên tắc: dùng dung môi ở nhiệt độ cao sẽ chiết liên tục và chiết kiệt đối
tƣợng phân tích trong mẫu đã làm nhỏ (xem Hình 1.4). Thời gian chiết phụ thuộc bản chất mẫu.
Ứng dụng và ưu, nhược điểm: Một số tác giả đã sử dụng chiết Soxhlet để chiết
hóa chất BVTV trong nông sản, chè, dƣợc liệu, đất. Đây là kỹ thuật chiết kinh điển nhƣng khá hiệu quả. Nhƣợc điểm là thƣờng tốn dung mơi hữu cơ và thời gian chiết dài.
Hình 1.3. Mơ hình chiết siêu âm
Hình 1.4. Mơ hình chiết Soxhlet
1.4.2.4. Chiết rắn –lỏng bằng ỹ thuật vi sóng
Nguyên tắc: Kỹ thuật này đƣợc phát triển rộng khắp trong vài năm qua. Mẫu
và dung mơi chiết đƣợc gia nhiệt bằng lị vi sóng, có sự kiểm sốt về áp suất, nhiệt độ và năng lƣợng.
Áp dụng và ưu nhược điểm: Kỹ thuật này cho hiệu quả chiết tƣơng tự chiết
soxhlet, tuy nhiên giảm đƣợc thời gian chiết (thời gian chiết khoảng 15 phút) và giảm đƣợc dung môi chiết so với kỹ thuật chiết soxhlet (dung môi sử dụng 25÷50ml) và đã đƣợc áp dụng nhiều trong phịng thí nghiệm.
Các tác giả Edwar Fluentes, María E. Báez, Ronnie Labra [32] đã tiến
Dung môi phổ biến: Acetone:hexan (1:1,v/v) Acetone:CH2Cl2 (1:1,v/v) Hexan (phân tích PCBs) Đầu dị siêu âm Dung mơi (100 ml) 30g đất
Phƣơng pháp này sử dụng dung môi chiết là nƣớc- methanol, thêm KH2PO4 vào dung dịch chiết, tối ƣu hóa các điều kiện chiết, dịch chiết đƣợc cô đặc và định lƣợng trên GC-FPD. Độ thu hồi của phƣơng pháp >73 % (trừ methyl parathion trong một số loại đất), SD <11%, giới hạn phát hiện nằm trong khoảng 0,004-0,012 µg/g.
1.4.3. Phương pháp chiết pha rắn SPE (solid phase extraction)
Nguyên tắc: SPE là phƣơng pháp xử lý mẫu dựa trên nguyên tắc sắc ký lỏng
nhằm loại các ảnh hƣởng của nền mẫu hoặc làm giàu đối tƣợng phân tích trƣớc phân tích (xem Hình 1.5).
Hình 1.5. Các bƣớc thực hiện của phƣơng pháp SPE
Áp dụng và ưu nhược điểm: Một số tác giả đã sử dụng phƣơng pháp SPE để
chiết và làm sạch hóa chất BVTV trong rau quả. Ƣu điểm là lƣợng dung môi sử dụng thƣờng nhỏ (< 10 ml), thời gian chiết nhanh, tỷ lệ thu hồi cao, không tạo nhũ tƣơng, độ lặp lại tốt. Tuy nhiên cột SPE nhồi sẵn có giá thành tƣơng đối cao.
Các tác giả E. Ballesteos, M.J. Parrado [31] đã tiến hành chiết TTS
photpho hữu cơ trong nƣớc uống và nƣớc tự nhiên bằng phƣơng pháp chiết pha rắn SPE. Hệ thống bao gồm cột hấp phụ dùng để cô đặc nồng độ TTS photpho hữu cơ và đƣợc rửa gải bằng ethyl acetate, trong đó vật liệu hấp thụ là RP-C18 cho kết quả tốt nhất. Mẫu đƣợc cô đặc và xác định hàm lƣợng trên GC-NPD và GC-FID. Giới hạn phát hiện đối với detectơ NPD là 50-130 ng/l; với FID là 4,5-11,7 g/l. Độ chính xác là 2,9-4,3% , độ thu hồi của phƣơng pháp nằm trong khoảng 93,8 -104,5%.
1.4.4. Phương pháp vi chiết pha rắn SPME (solid phase microextraction)
Nguyên tắc: SPME là quá trình chiết và tự làm giàu một cách chọn lọc chất
phân tích khơng phân cực từ mẫu lỏng phân cực lên pha tĩnh lỏng không phân cực phủ trên bề mặt sợi vi chiết. SPME là quá trình chiết đạt tới cân bằng tuân theo định luật phân bố, trong q trình chiết thì mẫu ln đƣợc khuấy trộn [24], [38].
Thiết bị: Sợi làm bằng silica nung chảy phủ lớp pha tĩnh mỏng (carbowax,
PDMS), đặt trong lịng một chiếc kim gắn với một pít - tơng làm bằng thép không gỉ. Tổ hợp này đƣợc đặt trong bộ phận bảo vệ (sy-ranh).
Áp dụng và ưu nhược điểm: ban đầu SPME đƣợc áp dụng để chiết các chất
cơ clo trong môi trƣờng. Gần đây SPME đã đƣợc áp dụng trong nhiều lĩnh vực nhƣ dƣợc phẩm, sinh học… Ƣu điểm của phƣơng pháp là rất nhạy, không sử dụng dung môi hữu cơ. Nhƣợc điểm là giá thành còn đắt, thời gian chiết kéo dài.
1.4.5. Phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn SFE (Supercritical fluid extraction) Nguyên tắc: Chiết siêu tới hạn là loại chiết ra đời muộn nhất, vào giữa
những năm 80 của thế kỷ 20 đƣợc thực hiện khi cho chất lỏng siêu tới hạn (là chất có nhiệt độ và áp suất cao hơn giá trị tới hạn) tiếp xúc với cột chiết. Nhờ tính chất đặc biệt của chất lỏng siêu tới hạn mà các chất phân tích, đặc biệt là các chất có khối lƣợng phân tử lớn có khả năng chiết chọn lọc bằng phƣơng pháp này.
Áp dụng và ưu nhược điểm: SFE đƣợc sử dụng để xác định số lƣợng lớn
thành phần của chất béo từ trong thịt lợn tới dầu hạt giống và rau quả. SFE cịn đƣợc dùng để phân tích TTS trong thực phẩm. Ƣu điểm của chiết siêu tới hạn hơn các phƣơng pháp chiết truyền thống đó là tốn ít thời gian, dung mơi. Thêm vào đó, chiết siêu tới hạn dễ dàng thay đổi lực dung môi bằng cách thay đổi nhiệt độ và áp suất của quá trình chiết.
Các tác giả Kevin N.T. Norman, Sean H.W. Panton [40] đã dùng phƣơng pháp tự động hóa sử dụng CO siêu giới hạn và làm sạch bằng chiết pha rắn (SPE) để xác định 10 TTS OPs trong lúa mì và ngơ đã đƣợc thêm chuẩn từ 0,05-0,5 mg/g. Độ thu hồi tốt, cao hơn so với chiết lỏng (LE) và sắc ký gel (GPC). Giới hạn phát