CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.3. Phương pháp phân tích tuyến trùng
Xác định thành phần và số lượng tuyến trùng ký sinh thực vật trong mẫu đất và mẫu rễ được thực hiện tại Phòng Tuyến trùng, Viện Sinh thái và Tài Nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Tách lọc tuyến trùng trong đất: Tuyến trùng trong đất được tách lọc bằng
phương pháp lọc tĩnh của Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (1992) trên cơ sở cải biên phương pháp lọc rây của Cobb (1918) (Nguyễn Ngọc Châu, 2003): Cân 250g đất cho vào xơ nhựa chứa 2 lít nước, bóp vụn và khuấy đều. Sử dụng rây lọc thô để loại bỏ sỏi nhỏ, cặn đất và rác hữu cơ. Gạn lọc dung dịch đất có chứa tuyến trùng nhiều lần để loại bỏ hết các cấp hạt lớn, chỉ còn lại dịch tuyến trùng ở dạng huyền phù. Sau đó, dịch tuyến trùng được lọc qua rây lọc có đường kính lỗ 40 μm, rửa bằng nước sạch, thu tuyến trùng phía trên rây lọc vào rây lọc tĩnh có kích thước lỗ rây 63 μm. Đặt rây lọc tĩnh vào đĩa petri nhựa 90 mm, điều chỉnh lượng nước cho phù hợp. Sau khi lọc để lắng 48 giờ thu được dung dịch nước lắng trong đĩa petri để quan sát và đếm số lượng tuyến trùng thu được.
Đếm số lượng tuyến trùng: Sau khi tách lọc, dung dịch chứa tuyến trùng
được đếm và tính số lượng trong đĩa đếm và đồng hồ đếm dưới kính hiển vi soi nổi Zeiss. Nếu mẫu có ít tuyến trùng (<500 cá thể), đếm toàn bộ các cá thể trong đĩa. Mẫu có 500-2.000 cá thể, sau khi lắc nhẹ cho dung dịch dàn đều, đếm số lượng tuyến trùng ở các ô theo đường chéo đĩa, sau đó nhân với tổng số ơ trong đĩa. Trong trường hợp mẫu có q nhiều tuyến trùng, pha lỗng mẫu trước khi đếm số lượng tuyến trùng.
Cố định tuyến trùng: Tuyến trùng thu được được cố định bằng nhiệt ở nước
nóng từ 50 – 60oC, sau đó chuyển sang lọ nhựa và bảo quản trong dung dịch TAF (Nguyễn Ngọc Châu, 2003).
Làm trong tuyến trùng và lên tiêu bản cố định tuyến trùng: Để phục vụ cho
việc nghiên cứu lâu dài cần tiến hành xử lý và làm tiêu bản cố định tuyến trùng. Trước khi xử lý mất nước cho mẫu tuyến trùng thì cố định tuyến trùng trong thời gian từ 4 - 5 ngày trong dung dịch TAF, sau đó cho vào glycerin theo phương pháp
bay hơi của Seinhorst: Gắp tuyến trùng đã được cố định sang đĩa thủy tinh lõm chứa dung dịch I (gồm cồn 96o, glycerin và nước cất với tỷ lệ 20:1:79). Đĩa thủy tinh được đậy nắp và đặt trong bình cồn 96oC, đặt bình cồn trong tủ ấm 40oC trong tối thiểu 12 giờ. Sau đó, chuyển đĩa thủy tinh ra khỏi bình cồn, vẫn giữ trong tủ ấm và mở 1/3 nắp đậy, bổ sung thêm dung dịch II (gồm cồn 96o và glycerin với tỷ lệ 95:5) với tần suất 3 giờ/lần, thực hiện trong 24 giờ. Sau đó tiến hành lên tiêu bản cố định: Dùng ống đồng để khoang các vịng parafilm trên lam kính (Ф ≈ 10 mm), nhỏ 1 giọt glycerin ở giữa vòng parafilm, gắp tuyến trùng đã được làm trong vào giữa giọt parafilm, sắp xếp các cá thể tuyến trùng để đảm bảo không các thể nào xếp chồng lên nhau. Đậy lamen, đặt lam kính trên thanh nhôm và đốt trên đèn cồn đến khi lamen gắn trên lam kính (Nguyễn Ngọc Châu, 2003).
Phân loại tuyến trùng: Tuyến trùng sau khi lên tiêu bản được đo vẽ trên kính
hiển vi ZEISS Primor Star và phân loại theo tài liệu của Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (2000) và Siddiqi (2000).
Nhuộm tuyến trùng trên rễ thực vật: 5g mẫu rễ được nhuộm theo phương
pháp nhuộm tuyến trùng trong mô thực vật của Nguyễn Ngọc Châu (2003), sử dụng dung dịch axit fuchsin. Tuyến trùng ký sinh trên rễ thực vật sau khi được nhuộm bắt màu đỏ cịn mơ thực vật khơng bắt màu và có thể dễ dàng quan sát tuyến trùng dưới kính hiển vi soi nổi độ phóng đại 40X (Nguyễn Ngọc Châu, 2003).