1.3.1. Ký sinh trên tác nhân gây bệnh
Một số nhóm VSV được sử dụng như tác nhân phịng trừ sinh học triển vọng do có khả năng ký sinh trực tiếp trên mầm bệnh. Vi khuẩn Pasteuria penetrans ký sinh bắt buộc ở một số loài tuyến trùng thực vật như Meloidogyne spp. và Pratylenchus spp., do đó làm giảm mật độ tuyến trùng. Nấm Paecilomyces spp.
được đánh giá cao về khả năng kiểm soát tuyến trùng do khả năng ký sinh trực tiếp lên trứng, ấu trùng và con cái. Nấm phát triển thúc đẩy hình thành mạng lưới sợi nấm cùng với gelatin làm trứng và tuyến trùng bị mắc trên mạng lưới hoặc bị nhấn chìm. Đồng thời, các sợi nấm có thể xâm nhập vào trong trứng và phá hủy các giai đoạn phát triển phôi ở giai đoạn sớm (Ajrami, 2016). Nấm Oidium spp. gây bệnh
phấn trắng trên nhiều cây trồng có thể bị ký sinh bởi một số loài VSV đối kháng như Acremonium alternatum, Acrodontium crateriforme, Ampelomyces quisqualis, Cladosporium oxysporum và Gliocladium virens (Aboutorabi, 2018).
1.3.2. Sản sinh ra hoạt chất kháng sinh
Kháng sinh là các hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp được sản sinh bởi VSV, đóng vai trị quan trọng trong phịng trừ một số loài dịch hại bằng cách cạnh tranh hoặc ký sinh (Raguchander và cs, 2011). Một số nhóm vi khuẩn vùng rễ được báo cáo có thể sản xuất ra các kháng sinh để tiêu diệt các sinh vật gây hại, giúp tạo môi trường thuận lợi để cây phát triển tốt hơn. Trong đó, Pseudomonas spp. và Bacillus
spp. là những đại diện điển hình được xác định sản sinh ra các chất chuyển hóa thứ cấp kháng nấm và vi khuẩn như iturin A, surffactin, phenazines, pyrrolnitrin, 2,4- diacetylphloroglucinol (DAPG) và pyoluteorin (Aboutorabi, 2018; Rahman và cs, 2018). Theo Li và cs (2007), có khoảng 230 hoạt chất đã được phân lập từ trên 270 loài nấm gây bất hoạt tuyến trùng bao gồm alkaloit, hợp chất peptit, terpenoid, macrolit, heterocycle oxy,…. (Li và cs, 2007). Theo Abd-Elgawad và cs (2010), vi khuẩn
Pseudomonas fluorescence và Bacillus subtilis làm giảm quần thể nấm Fusarium spp.
và mật độ ấu trùng T. semipenetrans trong đất trồng cam ở Ai Cập, đồng thời giúp tăng năng suất (trên 90 kg/cây) hơn so với việc sử dụng thuốc hóa học Kocide và Carbofuran (80-85 kg/cây) (Abd-Elgawad và cs, 2010). Theo Siddiqui và Mahmood
(2001), sử dụng Azospirillium, Azotobacter, Rhizobium và nấm rễ Glomus sp. làm giảm đáng kể sần rễ do tuyến trùng Meloidogyne javanica gây ra (Siddiqui & Mahmood,
2001). Hai loại thuốc kháng sinh sản xuất từ nấm L. squarrosulus có tác dụng ức chế nấm R. lignosus và Mucor ramanninus (Mensah và cs, 2018).
1.3.3. Sản sinh các enzym thủy phân
Một trong những cơ chế giúp VSV tiêu diệt tác nhân gây bệnh là sản sinh ra các enzym thủy phân như chitinase, peroxidase, phenylalanine ammonia lyase, dehydrogenase, lipase, β-glucanase, protease và phospholipase. Thành phần hóa học của thành tế bào vi khuẩn và nấm rất phức tạp bao gồm nhiều hợp chất khác nhau như peptidoglycan, polisaccarit, protein, lipoprotein, axit tecoic, lipoit, … Do đó, khi các đối kháng sản sinh enzym thủy phân sẽ phá hủy thành tế bào của vi khuẩn và nấm, dẫn đến làm giảm số lượng của các tác nhân gây bệnh cây trồng. Nấm
Trichoderma, Streptomyces và Paecilomyces tiết ra các enzym thủy phân hòa tan thành tế bào của nấm, vi khuẩn và tuyến trùng, đồng thời ký sinh trực tiếp lên mầm bệnh (Ajrami, 2016; Syed và cs, 2018). Theo Insunza và cs (2002), 3 loài vi khuẩn
Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus mycoides và Pseudomonas sp. làm giảm
quần thể tuyến trùng Trichodorus lên đến 56 – 74% do có khả năng sản sinh ra các enzym thủy phân và HCN (Insunza và cs, 2002). Dịch bào tử nấm Paecilomyces có chứa các enzym thủy phân như chitinase và protease gây chết 99% ấu trùng
M. incognita chỉ sau 2 ngày gây nhiễm (Abd-Elgawad và cs, 2010; Kader, 2008).
1.3.4. Thúc đẩy tăng trưởng thực vật
Rất nhiều lồi vi khuẩn nội kí sinh, vi khuẩn sống tự do trong vùng rễ thực vật sử dụng các chất dinh dưỡng giải phóng từ cây chủ, và tiết ra các phytohormone và siderophore, giúp thúc đẩy tăng trưởng thực vật. Sự tương tác gián tiếp giữa vi khuẩn và thực vật làm tăng nguồn cung cấp dinh dưỡng cho sự phát triển của cây trồng, như cố định Nitơ khí quyển hoặc hịa tan photpho trong đất. Vì vậy, thực vật phát triển một cách khỏe mạnh và tăng khả năng chống chịu của cây trồng đối với các stress mơi trường, trong đó bao gồm cả các tác nhân gây bệnh.
Các phytohormone sản sinh bởi nhóm vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật (PGPR-Plant growth promoting rhizobacteria) như auxin, axit axetic indole (IAA), gibberellin, cytokinin và một số hợp chất khác đóng vai trị quan trọng tương tác giữa vi khuẩn-thực vật, kích thích sự phân chia và kéo dài tế bào, phát triển mơ, từ đó ảnh hưởng tích cực đến sự phát triển và năng suất thực vật. Theo báo cáo của Ruanpanun và cs (2010), phytohormone sản xuất bởi xạ khuẩn Streptomyces sp. làm giảm tỷ lệ nở trứng của tuyến trùng Meloidogyne incognita lên đến 33,1% và tăng
tỷ lệ chết của ấu trùng lên 82% so với đối chứng (Ruanpanun và cs, 2010).
Thực vật cần được cung cấp đầy đủ các dinh dưỡng thiết yếu để đảm bảo sự phát triển bình thường. Tuy nhiên, các nguyên tố dinh dưỡng cần thiết cho cây trồng chủ yếu tồn tại ở dạng khó hịa tan mà cây trồng khơng thể sử dụng trực tiếp được. Do đó, sự hiện diện của các nhóm vi khuẩn giúp cố định Nitơ, hịa tan các khống chất đóng vai trị rất quan trọng đối với dinh dưỡng thực vật, ảnh hưởng đến sự phát triển của thực vật và hàm lượng dinh dưỡng dễ tiêu. Một số vi khuẩn thuộc các chi
Paenibacillus, Bacillus và Pseudomonas vừa thúc đẩy tăng trưởng thực vật, vừa làm giảm quần thể tuyến trùng trong vùng rễ (Mhatre và cs, 2019). Nấm rễ AMF có vai trị quan trọng đặc biệt đối với đời sống của cây chủ, đồng thời giúp hình thành liên kết và bảo vệ cấu trúc đất. Mạng lưới hệ sợi nấm phát triển từ trong tế bào rễ của cây chủ kéo dài ra phía ngồi rễ ít nhất là 12 cm giúp mở rộng vùng tiếp xúc của rễ thực vật ra xa, ước tính tổng chiều dài hệ sợi nấm có thể lên đến 40-160 cm/g đất. Do đó, AMF giúp cây chủ tăng cường khả năng hút nước và các chất dinh dưỡng khoáng, tăng sức đề kháng và khả năng chống chịu khi gặp điều kiện bất lợi như khô hạn hoặc độc chất, đồng thời giúp tăng khả năng chống chịu của cây đối với tuyến trùng (Hol & Cook, 2005; Ortas, 2012; Wu và cs, 2013).
1.3.5. Biện pháp cải tạo đất
Bên cạnh việc sử dụng trực tiếp các chủng VSV để phòng trừ các loại bệnh cây, các biện pháp cải tạo đất tạo môi trường thuận lợi cho thực vật các nhóm sinh vật đối kháng phát triển cũng được áp dụng phổ biến để phòng trừ bệnh hại phát sinh từ đất.
Cải tạo đất bằng cách sử dụng các vật liệu hữu cơ như tàn dư thực vật, phân xanh, phân chuồng, … giúp bổ sung một lượng đáng kể các nhóm VSV vào trong đất, tạo điều kiện tăng cường hòa tan các chất dinh dưỡng cung cấp cho cây trồng. Sử dụng phân chuồng ủ hoai mục làm giảm mật độ tuyến trùng Meloidogyne incognita trong đất trồng hồ tiêu từ 45-60% so với đối chứng (Nguyễn Ngọc Châu, 2003). Theo Campell và cs (1994), bổ sung chất hữu cơ vào đất giúp kiểm soát bệnh thối rễ do
Thielaviopsis basicola gây ra (Campbell, 1994). Bổ sung một số chất thải có nguồn
gốc sinh học như chitin có thể kích thích các VSV phân hủy chitin, từ đó làm giảm giảm số lượng tuyến trùng (El-Sayed & Mahdy, 2015; Patel & Goyal, 2017).
1.4. Tình hình nghiên cứu tuyến trùng ký sinh thực vật ở Việt Nam
Nghiên cứu về tuyến trùng ở Việt Nam mới chỉ chính thức bắt đầu từ những năm 1970 ở một số trường đại học và trung tâm nghiên cứu như Trường Đại học Quốc gia, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh Vật, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Viện Bảo vệ Thực vật (Nguyễn Ngọc Châu, 2003). Các nghiên cứu tập trung vào xác định mức độ đa dạng về thành phần loài tuyến trùng thực vật và mức độ gây hại của chúng trên các loại cây trồng chính như lúa, ngơ, cà phê, hồ tiêu, cây thuốc, rau màu. Cho đến nay đã ghi nhận có 250 lồi tuyến trùng ký sinh cây trồng ở Việt Nam, trong đó một số giống được xác định là ký sinh gây hại phổ biến trên nhiều loại cây trồng như Meloidogyne, Pratylenchus, Radopholus, Rotylenchus, Helicotylenchus, Ditylenchus và Hirschamanniella (Nguyễn Ngọc Châu, 2003; Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh, 1993). Theo Vũ Anh Tú và cs (2014) đã ghi nhận có 11 giống tuyến trùng thực vật ký sinh trong rễ và đất trồng cà phê Easao ở tỉnh Gia Lai, trong đó giống gây hại chính là Meloidogyne spp. và
Pratylenchus spp. (Vũ Anh Tú và cs, 2014). Nguyễn Hữu Tiền và cs (2013) đã ghi
nhận có 13 lồi tuyến trùng ký sinh trên cây dược liệu ở Đông Triều, Quảng Ninh. Các nhóm tuyến trùng gây hại phổ biến và nghiêm trọng gồm Meloidogyne spp., Pratylenchus coffeae, P. brachyurus, Helicotylenchus dihystera và R. reniformis
(Nguyễn Hữu Tiền và cs, 2015). Những nghiên cứu về tuyến trùng trên cây có múi vẫn còn rất hạn chế. Năm 1983, Nguyễn Bá Khương đã phát hiện 8 giống tuyến
trùng ký sinh trên cây cam (Khuong, 1983). Đến năm 2002, Nguyễn Vũ Thanh ghi nhận có 34 lồi tuyến trùng trên cây cam ngọt (Citrus sinensis), trong đó các lồi
Tylenchulus semipenetrans, Pratylenchus spp., Meloidogyne spp., và Xiphinema
spp. là những mối nguy hiểm thật sự đối với sản xuất cam (Nguyễn Vũ Thanh, 2002). Mức độ gây hại của lồi này đối với cây chủ tăng lên khi có mặt các mầm bệnh khác như Cylindrocladium crotalariae, Fusarium spp., Verticillium spp.
(Nguyễn Ngọc Châu, 2003).
Đối với một số cây trồng như cà phê, hồ tiêu, cây dược liệu, … tuyến trùng ký sinh thực vật là mối đe dọa nghiệm trọng. Vì vậy, cần phải đưa ra các biện pháp để phòng trừ tuyến trùng, làm giảm thiểu tác hại của chúng gây ra đối với cây chủ. Do những tác động tiêu cực của các biện pháp hóa học đến an toàn thực phẩm, sức khỏe con người và chất lượng môi trường, các biện pháp thay thể đã được tập trung nghiên cứu và phát triển. Nhờ khả năng sản sinh ra các độc tố, một số loại cây trồng và cây hoang dại được sử dụng làm thuốc thảo mộc trong phòng trừ tuyến trùng. Các chế phẩm HBJ và LBJ sản xuất từ bột quả cà bột lá cây sầu đâu rừng có thể phòng trừ tuyến trùng từ 75-98% (Nguyễn Ngọc Châu, 2003; Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh, 1993). Ở nồng độ 2%, thuốc thảo mộc Sông Lam chiết xuất từ vỏ mãng cầu xiêm làm giảm mật độ của các giống tuyến trùng Meloidogyne, Pratylenchus, Paratrichodorus, Rotylenchus, Hemicriconemoides và
Tylenchorhynchus từ 85-95% sau 7 ngày xử lý (Nguyễn Ngọc Châu và Trịnh Quang
Pháp, 2005). Tuy nhiên, việc sử dụng các loại thuốc thảo mộc có hiệu lực thấp, nguồn nguyên liệu hạn chế, giá thành cao, do đó khả năng áp dụng cịn hạn chế.
Sử dụng các vi sinh vật đối kháng có nguồn gốc từ đất như nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn được xem như là phương pháp phòng trừ tuyến trùng có triển vọng và tiềm năng áp dụng vào thực tế cao. Một số kết quả điều tra bước đầu cho thấy có trên 20 lồi tuyến trùng trong tự nhiên bị nhiễm vi khuẩn Pasteuria penetrans. Loài này làm giảm mật độ quần thể tuyến trùng Meloidogyne trong chậu đến 99% trong 3 tuần (Nguyễn Ngọc Châu, 2003). Theo Nguyễn Văn Dũng và cs (2016), sử dụng 2
chế phẩm K-18 và SH-BV1 có thành phần gồm thảo mộc, enzym thủy phân và các loài nấm đối kháng làm giảm mật độ tuyến trùng hại cà rốt ở Hải Dương và Lâm Đồng từ 68-78% (Nguyễn Văn Dũng và cs, 2016). Lê Thị Mai Linh và cs (2017) đã nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn Lysobacter antibioticus đến tuyến trùng sần rễ
Melodogyne incognita trong điều kiện phịng thí nghiệm. Dịch chiết vi khuẩn L. antibioticus làm giảm số lượng tuyến trùng M. incognita từ 32,1% đến 53,3% sau
120 theo dõi. Trong khi đó, kháng sinh 4-HYDROXYLPHENYLACETIC (4- HPAA) sản sinh trong quá trình nhân nuôi vi khuẩn L. antibioticus ảnh hưởng rất
lớn đối với tuyến trùng M. incognita, tỷ lệ nở trứng chỉ đạt 11,8% và tỷ lệ chết của ấu trùng đạt trên 90% ở nồng độ 2,5 mg/ml (Lê Thị Mai Linh và cs, 2017). Enzym chitinase được sản sinh ra từ hàng loạt các loài sinh vật bao gồm nấm, vi khuẩn, virus, xạ khuẩn, côn trùng, động và thực vật. Khả năng phòng trừ tuyến trùng của enzym này đã được chứng minh bởi các nghiên cứu trong và ngoài nước. Theo Nguyễn Thị Duyên (2019), các nấm Paecilomyces sp. và Lentinus squarrosulus sản sinh ra enzym chitinase làm giảm mật độ của tuyến trùng Pratylenchus penetrans và
Meloidogyne incognita trong điều kiện phịng thí nghiệm lên đến 94% sau 168h
quan sát. Như vậy, việc sử dụng các chất chiết từ sinh vật đối kháng có tiềm năng thương mại hóa do khả năng phịng trừ tốt (Nguyễn Thị Duyên, 2019).
Ngồi ra, có thể sử dụng các nhóm VSV hữu ích trong đất để thúc đẩy tăng trưởng thực vật, từ đó tăng sức chống chịu của cây đối với tuyến trùng. Chế phẩm EM được đưa vào Việt Nam từ năm 1997, nhiều cơ sở sản xuất, nghiên cứu và thử nghiệm ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Trong chế phẩm EM bao gồm tập hợp các VSV kỵ khí và hiếu khí, chúng tạo ra một hệ thống vi sinh thái, cộng sinh với nhau, có tác dụng hỗ trợ lẫn nhau, thúc đẩy sự phát triển của thực vật. Sử dụng chế phẩm EMINA cho cây khoai tây làm tăng năng suất từ 4,8 đến 22,2%, giảm bệnh vàng lá do nấm Fusarium sp. (Nguyễn Quang Thạch, 2010). Mối quan hệ cộng sinh của lồi AMF với thực vật chủ đóng vai trị quan trọng giúp cây trồng phát triển thuận lợi. Nguyễn Thị Kim Liên và cs (2012) đã phân lập được 16 loài AMF ở mẫu đất và rễ
cam ở vùng trồng cam tại Quỳ Hợp, Nghệ An thuộc 6 chi 6 chi Acaulospora, Entrophospora, Glomus, Sclerocystic, Glomites và Gigaspora (Nguyễn Thị Kim Liên và cs, 2012).
Như vậy, nghiên cứu tuyến trùng ký sinh thực vật ở Việt Nam chủ yếu chỉ dừng lại ở việc xác định thành phần loài. Đã có những nghiên cứu để phòng trừ tuyến trùng thực vật, tuy nhiên tập trung nghiên cứu vào giống gây hại cho nhiều loại cây trồng như Meloidogyne spp. và Pratylenchus spp. Những nghiên cứu về
tuyến trùng ký sinh trên cây cam vẫn còn rất hạn chế và được thực hiện từ khá lâu trước đây (từ năm 2002). Bên cạnh đó, vẫn chưa có nghiên cứu nào về phòng trừ tuyến trùng T. semipenetrans – lồi gây hại chủ yếu cho các vườn cây có múi.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Tuyến trùng thực vật ký sinh trong vùng rễ cây cam được trồng tại vùng trồng cam Cao Phong, Hịa Bình, trong đó tập trung vào lồi T. semipenetrans.
- Đất nghiên cứu là đất xám Feralit (Ferralic Acrisols), có độ dày tầng đất trung bình 1,5 đến trên 2 m.
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu: Các vườn trồng cam có thời gian canh tác từ 1 đến 20
năm nằm trên địa bàn huyện Cao Phong, tỉnh Hịa Bình. Khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, có mùa đơng lạnh, nhiệt độ trung bình 23,5oC, độ ẩm tương đối trung bình 85%. Lượng mưa trung bình hàng năm là 1.700 mm.
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 1 năm 2016 đến hết tháng 12 năm 2019
2.2. Nội dung nghiên cứu
1) Điều tra tình trạng bệnh hại cam ở các vườn trồng cam tại huyện Cao Phong, tỉnh Hịa Bình;
2) Nghiên cứu xác định thành thành phần tuyến trùng ký sinh thực vật và một số tính chất cơ bản của đất để làm cơ sở xác định biểu hiện thối hóa chất lượng đất trồng cam tại vùng nghiên cứu;
3) Nghiên cứu hiệu quả của một số chế phẩm sinh học trong phòng trừ tuyến trùng T. semipenetrans ở điều kiện phịng thí nghiệm và nhà lưới nhằm đề xuất
được loại chế phẩm sinh học và nồng độ tối ưu để phòng trừ tuyến trùng.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tổng hợp tài liệu, thông tin
Các tài liệu, thông tin được thu thập, tổng hợp và xử lý từ các cơng trình nghiên cứu trong và ngồi nước, qua sách, báo cáo, tạp chí khoa học có uy tín.
2.3.2. Phương pháp điều tra, khảo sát thực địa và lấy mẫu nghiên cứu
Phương pháp điều tra, khảo sát thực địa: Phỏng vấn trực tiếp các chủ vườn cam để thu thập thông tin về lịch sử hoạt động canh tác, các loại sâu bệnh hại và biện
pháp phịng trừ, các loại hóa chất BVTV sử dụng tại các vườn cam điều tra (Phiếu