CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
2.1.2. Nguồn vi sinh vật
Các chủng vi khuẩn kiểm định cũng như các thông tin về môi trường nuôi cấy và nhiệt độ nuôi cấy của các chủng vi sinh vật kiểm định và các chủng vi sinh vật gây bệnh được lần lượt liệt kê trong Bảng 2.1. và 2.2.
Chủng vi khuẩn kiểm định
Bảng 2.1. Các chủng vi khuẩn kiểm định
STT Vi khuẩn kiểm định Kí hiệu
Mơi trường ni cấy Nhiệt độ nuôi cấy
1 Micrococcus luteus IFO 12708 KĐ24 TSBYE 30oC 2 Lactococcus lactis subsp. lactis
ATCC 1935 KĐ26 MRS 30oC 3 Lactobacillus sakei subsp. sakei
JCM 1157 KĐ28 MRS 30oC 4 Pediococcus pentosaceus JCM 5885 KĐ32 MRS 37oC 5 Enterococcus faecalis JCM 5803 T KĐ34 MRS 37oC
Các chủng vi sinh vật gây bệnh
Bảng 2.2. Các chủng vi sinh vật gây bệnh
STT Vi sinh vật gây bệnh Môi trường
nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy 1 Escherichia coli VTCCB 482 LB 37oC 2 Klebsiella pneumonia VTCCB 815 LB 37oC 3 Acinetobacter baumannii VTCCB 823 LB 37oC 4 Pseudomonas aeruginosa VTCCB 657 LB 37oC 5 Salmonella enterica VTCCB 480 LB 37oC 6 Staphylococcus aureus VTCCB 658 LB 37oC 7 Bacillus cereus VTCCB 613 LB 37oC 8 Enterobacter cloacae VTCCB 809 LB 37oC 9 Vibrio parahaemolyticus VTCCB 652 LB 37oC 10 Escherichia coli VTCCB 482 MRS 37oC
2.1.3. Mơi trường, hóa chất và thiết bị
2.1.3.1. Mơi trường ni cấy vi khuẩn
Môi trường MRS (g/L)
Thành phần môi trường MRS thạch bao gồm: pepton (10,0 g); cao thịt (10,0 g); cao nấm men (5,0 g); glucose (20,0 g); CH3COONa.3H2O (5,0 g); K2HPO4 (2,0 g); triammonium citrate (2,0 g); MgSO4.7H2O (0,5g); MnSO4.4H2O (0,28 g); CaCO3 (5,0 g) và agar (15,0 - 17,0 g).
Môi trường TSBYE (g/L)
Thành phần môi trường TSBYE thạch bao gồm: cao nấm men (1,8 g); bột đậu tương (0,9 g); glucose (0,75 g); NaCl (1,5 g); K2HPO4 (0,75 g) và agar (15,0 - 17,0 g)
Môi trường LB (g/L)
Thành phần môi trường LB thạch bao gồm: triptone (10,0 g); NaCl (10,0 g); cao nấm men (5,0 g) và agar (15,0 - 17,0 g)
2.1.3.2. Các hóa chất khác
Đệm axetat 0.02M pH = 5.5, đệm axetat 0.02M pH 5.5 có bổ sung NaCl. Hóa chất dùng trong sinh học phân tử: lyzosome, chloroform, phenol, isoamyl alcohol, isopropanol, EtOH 70%, agarose, Taq DNA polymerase, mồi đặc hiệu, mastermix, kháng sinh ampicillin, sol I (glucose, tris-HCl, EDTA pH8), sol II( NaOH, SDS), sol III (postassium acetate, acetic acid, nước cất), bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR thương mại (bio neer, INtRON), bộ vector thương mại pGEM-T (Promega).
2.1.3.3. Thiết bị chuyên dụng
Đề tài sử dụng các thiết bị có tại Phịng Cơng nghệ Enzym và Protein – Viện Vi sinh học và Công nghệ sinh học – Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Sơ đồ thí nghiệm được trình bày trong Hình 2.1:
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình thí nghiệm
Nghiên cứu sơ bộ bacteriocin Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum UL487 Thời gian ni cấy Tách dịng một số gen Ldh, csp, plnEF, pln A Xác định hoạt độ bacteriocin (AU/ml) Tinh sạch bacteriocin (Sắc ký trao đổi ion, HPLC ) Nhiệt độ nuôi cấy Đánh giá sự ảnh hưởng của pH, nhiệt độ Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
đến khả năng sinh bacteriocin Khảo sát ảnh hưởng của bacteriocin đối với một số vi sinh vật gây bệnh
2.2.2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp bacteriocin bacteriocin
2.3.2.1. Tối ưu thời gian nuôi cấy
Dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn trong môi trường MRS lỏng ở 30oC tại các thời điểm 24h, 48h, 72h được ly tâm 10.000 vòng/phút ở 4oC trong 20 phút để thu dịch trong. Sau đó, dịch trong này được nhỏ trên đĩa môi trường MRS đã chứa vi khuẩn kiểm định. Quan sát và đo đường kính vịng kháng khuẩn được thực hiện để tìm ra thời gian tối ưu nhất cho sự sinh tổng hợp bacteriocin.
2.2.2.2. Tối ưu nhiệt độ ni cấy
Q trình tối ưu hóa nhiệt độ được thực hiện tương tự như tối ưu hóa thời gian ni cấy. Hoạt tính kháng khuẩn tại các mốc nhiệt độ 30oC, 37oC được tiến hành đánh giá qua đường kính vịng kháng khuẩn. Sau thời gian thích hợp, quan sát kết quả và so sánh đường kính vịng kháng khuẩn nhằm xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin [40,48].
2.2.3. Một số tính chất của bacteriocin
2.2.3.1. Xác định hoạt tính kháng khuẩn
Hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin được phát hiện bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch [14,21]. Dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn được chỉnh đến pH 6 và nhỏ vào các giếng trên mơi trường thích hợp đã chứa 1% (v/v) vi sinh vật gây bệnh (Bảng 2.2). Sau 24 - 48 giờ, vòng kháng khuẩn được quan sát.
2.2.3.2. Xác định hoạt độ bacteriocin (AU/ml)
Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau 48h được tiến hành ly tâm 10.000 vòng/ phút ở 4oC trong 20 phút và thu dịch trong. Dịch trong được pha loãng theo hệ số 2 và nhỏ vào các giếng trên đĩa môi trường MRS đã chứa vi khuẩn kiểm định [25]. Sau 24 – 48h, hoạt tính bacteriocin được xác định bởi vòng kháng khuẩn xung quanh giếng và hoạt độ bacteriocin tính theo cơng thức sau:
(AU/ml) = 2n * 1000/V
Trong đó:
2n: Độ pha loãng theo hệ số 2 nhỏ nhất khơng xuất hiện vịng kháng khuẩn V: Thể tích dịch ni cấy đã nhỏ
2.2.3.2. Đánh giá ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin
Dịch ni cấy vi khuẩn sau 48h được tiến hành ly tâm 10.000 vòng/ phút ở 4oC trong 20 phút và thu dịch trong. Dịch nuôi cấy được điều chỉnh pH về 5; 5,5; 6; 7; 8; 9 bằng NaOH 1M, mẫu đối chứng là môi trường MRS lỏng đã được chỉnh đến các pH tương ứng và tiến hành nhỏ vào các giếng trên đĩa MRS thạch đã chứa vi khuẩn kiểm định. Sau 24 – 48h, đường kính vịng kháng khuẩn của mẫu ở từng pH được so sánh với nhauđể đánh giá ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin [67].
2.2.3.3. Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin
Tương tự như đánh giá ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin, các dịch ni cấy sau ly tâm được ủ ở 60oC (0 phút, 5 phút, 15 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút), 100oC (0 phút, 5 phút, 10 phút, 15 phút, 60 phút), 121oC (15 phút) và được sử dụng để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến bacteriocin [67].
2.2.4. Tinh sạch bacteriocin
2.2.4.1. Chương trình tinh sạch bacteriocin bằng hệ thống AKTA
Quá trình tinh sạch bacteriocin được thực hiện trên hệ thống AKTA với cột trao đổi cation HiTrap SP FF 1ml. Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau 48h được chỉnh về pH = 5,5 bằng NaOH 0,5M. Chương trình tinh sạch bacteriocin như sau:
Cột trao đổi cation HiTrap SP FF 1 ml
Dung dịch đệm: Đệm axetat 0,02M, (Đệm A), Đệm axetat 0,02M có bổ
sung muối NaCl 1M (Đệm B)
Tốc độ dòng chảy: 1 ml/phút Thể tích mẫu bơm lên cột: 8 ml Giai đoạn rửa giải:
- Chương trình 1: 7ml dung dịch đệm A + 30% đệm B; 8 ml dung dịch đệm A + 50% đệm B; 5ml dung dịch 100% đệm B.
- Chương trình 2: 5 ml dung dịch đệm A + 30% đệm B; 7 ml dung dịch đệm A + 60% đệm B; 5 ml dung dịch 100% đệm B.
Hoạt tính bacteriocin của mỗi phân đoạn được xác định trên đĩa mơi trường
MRS thạch có chứa vi khuẩn kiểm định.
Các phân đoạn sắc ký thu được sau khi tinh sạch qua hệ thống AKTA được tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn theo phương pháp đục lỗ trên đĩa môi trường MRS thạch có chứa vi khuẩn kiểm định 28 (KĐ28). Sau 24 – 48h, vòng kháng khuẩn được quan sát.
2.2.4.2. Chương trình tinh sạch bacteriocin bằng hệ thống HPLC
Các phân đoạn rửa giải có hoạt tính sau cột Hitrap SP FF 1 mL được tinh sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Chương trình tinh sạch bacteriocin như sau:
Cột sắc ký: Cột Semi C4 Dionex
Dung dịch đệm:
- Đệm A: Nước MilliQ có bổ sung 0,1% TFA (v/v) (Trifluoroacetic acid)
- Đệm B: Dung dịch acetonitrile 100%
Tốc độ dòng chảy: 2 mL/phút
Thể tích mẫu bơm lên cột: 1 mL
Chương trình chạy 0 phút – 0% đệm B; 10 phút – 0% đệm B; 10 phút – 10% đệm B; 25 phút – 25% đệm B; 25.10 phút – 100% đệm B; 40 phút – 100% đệm B; 40 phút – 0% đệm B; 50 phút – 0% đệm B. Protein được theo dõi ở độ hấp thụ 280 nm
Các đỉnh được thu sau quá trình rửa giải, cơ đặc và bảo quản ở -20oC. Hoạt tính bateriocin được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Sau 24 - 48 giờ, vòng kháng khuẩn được quan sát.
2.2.4.3. Xác định protein tổng số theo phương pháp Bradford
Phương pháp Bradford dựa trên phản ứng của protein với thuốc thử Coomassie Brilliant Blue (CBB) qua việc hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm với cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch. Ưu điểm của phương pháp này là độ nhạy cao, cho phép phát hiện vài g protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.
1 ml thuốc thử (0.01 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 hòa tan trong 5 ml etanol 95% và 10 ml axit photphoric 85%) được bổ sung vào ống nghiệm có chứa
20l mẫu, lắc đều và để ở nhiệt độ phịng khoảng 5 - 10 phút. Sau đó, mẫu được đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm. Đường chuẩn protein được dựng từ dung dịch Albumin nồng độ gốc 1 mg/ml. Từ số đọc của mẫu thí nghiệm, hàm lượng protein được xác định bằng tham chiếu với đồ thị chuẩn [9].
2.2.5. Phương pháp nhân dòng gen
2.2.5.1. Phương pháp tách DNA genome
Tách chiết DNA tổng số được thực hiện theo phương pháp của Sambrook và cộng sự bao gồm các bước [47]:
- Chủng vi khuẩn lactic nuôi cấy trên môi trường MRS lỏng ở 30°C trong 48 giờ
- Hút dịch nuôi cấy vào ống eppendorf 1.5 mL, ly tâm 10000 vòng/phút ở 4°C trong 10 phút để thu sinh khối tế bào
- Hòa cặn trong 0.5 mL Tris-HCl +MgCl2 pH8 (Tris - HCl 30mM (1.2g trong 300 mL H2O), MgCl2 3mM (0.2 g) để rửa tủa, sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn lại
- Hòa cặn trong 0.5 mL đệm Tris - HCl, MgCl2 và bổ sung 250 µL Lysozyme (nồng độ 20 mg/mL, 20 mg/1 mL đệm Bacillus Lysis Buffer). Mix đều 2 - 3 phút. Sau đó ủ 37oC trong 2 giờ
- Ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút bỏ dịch. Hòa tan trong 0.5 mL đệm Bacillus Lysis Buffer (100 mM NaCl + 50 nM EDTA pH 7.5) và bổ sung 100 µL SDS 10% (w/v). Sau đó ủ 37oC trong 15 phút
- Bổ sung 1 Vol Chloroform : Isoamy Alcolhol (C : I = 24 : 1), mix đều, ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút. Dịch trong ống phân 2 lớp, chuyển dịch phía trên sang ống eppendorf 1.5 mL mới
- Bổ sung 1 Vol Phenol : Cloroform : Isoamy Alcolhol (P : C : I = 25 : 24 : 1), mix đều, ly tâm 13000 vịng/15 phút. Chuyển dịch phía trên sang ống eppendorf 1.5 mL mới
- Bổ sung 1 Vol Chloroform : Isoamy Alcolhol (24 : 1), mix đều, ly tâm 13000 vòng/15 phút. Dịch trong ống phân 2 lớp, chuyển dịch phía trên sang ống eppendorf 1.5 mL mới
- Bổ sung 1/10 Vol Natri acetate 3M và 1 mL Ethanol 96%, mix đều, ủ đá trong 30 phút. Ly tâm ở 13000 vòng/5 phút, bỏ lớp dịch trên
- Rửa tủa bằng ethanol 70%, ly tâm nhanh 13000 vòng/phút, bỏ dịch, để cồn bay hơi hết. Hịa tan DNA bằng 50 µL H2O. Voltex và bảo quản ở -20 oC
2.2.5.2. Khuếch đoạn gen bằng PCR
Kỹ thuật PCR hay còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp là kỹ thuật cho phép nhân bản các đọa DNA (gen) lên hàng triệu lần so với ban đầu (1012 - 1013 bản sao). Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng tổng hợp DNA invitro của DNA polymerase. Phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ lặp lại của 3 bước cơ bản: biến tính, gắn mồi và tổng hợp, kết hợp với các cặp mồi cụ thể - đặc trưng cho từng gen liên quan. Trình tự các cặp mồi được trình bày ở Bảng 2.3 Bảng 2.3. Trình tự các cặp mồi Tên mồi Trình tự (5’ – 3’) Tm (oC) Kích thước Tài liệu tham khảo Pln A Pln A-F Gtacagtactaatgggac 53 450 bp [19] Pln A-R Cttacgccaatctatacg
plnEF Pln EF-F Ggcatagttaaaattcccccc 52.2 430 bp [19]
Pln EF-R Caggttgccgcaaaaaaag
M13 M13-F Tgtaaaacgacggccagt 50 200 bp universal primer
Thành phần phản ứng PCR trong tổng thể tích 50 µL bao gồm 2x PCR Master mix Solution (i-Taq): 7.5µl, mồi xi:1.2µl, mồi ngược: 1.2µl, DNA khn: 1µ, nước: 4.1µl.
Chu trình nhiệt: 94°C (3 phút), 30 chu kỳ (94°C - 30 giây, Tmồi - thời gian gắn mồi (giây), 72°C - 1 phút 30 giây), 72°C (10 phút).
2.2.5.3. Nhân dịng gen đích
Nhân dòng phân tử là một nhóm các phương pháp nhằm: (1) phân lập một đoạn gen (DNA) đặc hiệu từ một hỗn hợp các phân tử DNA ban đầu được tách chiết từ các mẫu sinh học có thành phần phức tạp, (2) nhân bản đoạn trình tự DNA được quan tâm lên một lượng đủ lớn để có thể tiến hành phân tích về cấu trúc và chức năng gen tương ứng.
Tiến hành phản ứng trong hộp đá. Trộn đều hỗn hợp, ủ hỗn hợp phản ứng ở 70oC trong 5 phút. Ủ hỗn hợp nối ở nhiệt độ phòng 25oC. Thành phần phản ứng chèn sản phẩm PCR vào vector bao gồm buffer 5 µl, T4 ligation 0,5 µl, vector 1 µl , sản phẩm PCR 2,5 µl, nước 1 µl.
Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủng E. coli DH - 5α bằng phương
pháp sốc nhiệt. Các bước tiến hành của phương pháp sốc nhiệt được thực hiện như sau: làm ấm SOC hoặc môi trường LB tại 37oC – 42oC. Làm tan tế bào khả biến trên đá. Thêm các sản phẩm được ligate (<2.5 µl) hoặc plasmid được tinh sạch (<50ng) trực tiếp tới tế bào khả biến khuấy nhẹ hỗn hợp và đặt lại trên đá. Ủ ống trong nước đá 30 phút. Gia nhiệt cho các ống chính xác ở 42oC. Thêm 950 µl mơi trường LB. Ủ trong 1h 37oC ủ lắc. Sau ủ, trải 20-200 µl tế bào trên mơi trường LB.
Sau khi tế bào khả biến được biến nạp và cấy trải trên đĩa thạch LB đặc có bổ sung ampicillin để qua đêm ở tủ ấm 37oC, những khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch sẽ được kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi riêng và mồi M13 để nhân đúng kích thước đoạn gen cần biến nạp có trong tế bào vi khuẩn.
2.2.5.4. Giải, phân tích trình tự và định danh vi khuẩn lactic
Sau khi kiểm tra sản phẩm PCR được giải trình tự tại hãng First Base (Singapore). Các trình tự được phân tích bằng phần mềm Bioedit 7.1.3.0 và so sánh với các trình tự nucleotide tương đồng trên Genbank bằng cách sử dụng công cụ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) để định danh chủng vi khuẩn lactic.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng vi khuẩn L. plantarum UL487 bacteriocin của chủng vi khuẩn L. plantarum UL487
Để có thể nghiên cứu một số tính chất của bacteriocin, trước hết điều kiện nuôi cấy của chủng L. plantarum UL487 (nhiệt độ và thời gian ni cấy) được tối ưu hóa để thu được bacteriocin có hoạt tính lớn nhất. Chúng tơi tiến hành nuôi cấy chủng này trong môi trường MRS lỏng ở 30oC và 37oC. Mẫu được thu tại các thời điểm 24h, 48h, 72h, 96h. Đây là các mốc nhiệt độ và thời gian để so sánh hoạt tính bacteriocin nhằm tìm ra điều kiện nuôi cấy tối ưu cho hoạt tính này cao nhất. Kết quả cho thấy ở 37oC chủng L. plantarum UL487 khơng sinh tổng hợp bacteriocin; cịn ở 30oC thì hoạt tính này là lớn nhất sau 24h ni cấy (Hình 3.1).
.
Hình 3.1 : Hoạt tính bacteriocin của chủng vi khuẩn L. plantarum UL487 với KĐ28 tại các thời điểm ni cấy khác nhau
Chú thích : 24h, 48h, 72h, 96h tại 30oC và 37oC là dịch nuôi cấy của chủng L. plantarum UL487 được thu tại các thời điểm 24h, 48h, 72h, 96h
tại nhiệt độ tương ứng.
Kết quả cho thấy, tại thời điểm 24h ở 30oC, tế bào có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin lớn nhất. Khi tăng thời gian nuôi cấy đến 48h thì hoạt tính bacteriocin bị giảm xuống cịn 88.23%. Khi kéo dài thời gian nuôi cấy, chủng vi khuẩn sẽ bước
vào pha suy vong, lượng tế bào chết tăng nhanh nên có thể ảnh hưởng lớn đến sự sinh tổng hợp bacteriocin. Ngồi ra, cũng có khả năng chủng vi khuẩn sẽ sản sinh ra môi trường nuôi cấy các loại enzyme ngoại bào (bao gồm cả protease) nên bacteriocin sẽ bị phân giải do bacteriocin có bản chất là protein. Bên cạnh đó, lactic acid sản sinh ra từ q trình lên men lactic đủ lớn có thể gây ức chế sinh trưởng của chính vi khuẩn này. Tại thời điểm 24h, hoạt tính bacteriocin thu được là cao nhất với đường kính vịng kháng khuẩn là 6.1 mm. Do đó, 24h được lựa chọn là thời gian tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin. Kết quả này tương tự với nghiên cứu