- Cột sắc ký: Hitrap SP FF 1ml - Tốc độ dòng: 1 ml/ phút - Thể tích phân đoạn: 0.5 ml
- Thể tích bơm mẫu: 8 ml dịch nuôi cấy sau ly tâm.
Bảng 3.2. Chương trình tinh sạch bacteriocin từ L. plantarum 487 bằng AKTA Chương trình Chương trình Đệm A Đệm B Chương trình rửa giải 5ml 30% 7ml 60% 7ml 100%
Hình 3.5. Sắc ký đồ dịch ni cấy chủng Lactobacillus plantarum UL487 qua cột HitrapSPFF 1ml
Kết quả sắc ký đồ dịch nuôi cấy chủng L. plantarum UL487 và kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn sau sắc ký được trình bày ở Hình 3.5.
Dựa trên sắc ký đồ (Hình 3.5) và kết quả kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn với KĐ28, quá trình tinh sạch thu được 3 đỉnh protein khá rõ ràng tương ứng với nồng độ muối là 0,3M; 0,6M và 1M. Trong đó, các phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn (từ phân đoạn B9 đến ống C4) thuộc giai đoạn rửa giải ở nồng độ muối 0,6M NaCl. Đặc biêt, phân đoạn từ B9 đến B1 thu được hoạt tính mạnh với đường kính vịng kháng lớn nhất.
Từ kết quả kiểm tra hoạt tính này, chúng tơi tiến hành thu protein từ các phân đoạn có hoạt tính. Sau đó, các phân đoạn này được gom với nhau (gọi chung là mẫu xuống cột) để tiến hành xác định hiệu suất và hoạt độ của bacteriocin sau quá trình tinh sạch
Kết quả tinh sạch bacteriocin bằng cột sắc ký trao đổi cation trên hệ thống AKTA được thể hiện trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Tổng kết quá trình tinh sạch bacteriocin của chủng L. plantarum UL487 bằng cột sắc ký trao đổi cation
Mẫu Thể tích (ml) Protein (mg/ml) Protein tổng số (mg) Hoạt độ AU/ml Hoạt độ riêng (AU/mg) Độ sạch Hiệu suất thu hồi bacteriocin (%) Dịch nuôi cấy 8 0.3 2.4 1066.67 3555.57 1 100 Mẫu xuống cột 4.5 0.014 0.065 266.67 19047.85 5.36 14.062
Kết quả Bảng 3.3 cho thấy, qua hệ thống tinh sạch AKTA, độ sạch của mẫu xuống cột tăng lên 5.36 lần so với dịch nuôi cấy thô ban đầu. Kết quả này thấp hơn so với nghiên cứu của Jianming Zhang và cộng sự ( 2018) (độ sạch của bacteriocin thu được đã tăng 827.01 lần bằng hai bước tinh sạch: kết tủa ammonium sulfate 80% và sắc ký trao đổi cation). Điều này có thể do bacteriocin trong nghiên cứu của
chúng tôi đoạn xuống cột bị lẫn một phần protein của Đỉnh 1 hay 2. Trong nghiên cứu của Jianming Zhang, bacteriocin trải qua kết tủa ammonium sulfate (phương pháp tinh sạch thô) trước khi được tinh sạch bằng sắc ký trao đổi cation. Phương pháp này giúp nâng cao hoat tính kháng khuẩn nhưng hiệu suất giảm đáng kể (hiệu suất đạt được là 11.36% so với ban đầu). Hiệu suất thu hồi bacteriocin từ vi khuẩn
L. plantarum UL487 (14.062 %) cao hơn 1.23 lần so với kết quả của Jianming Zhang và cộng sự [62]. Như vậy, chương trình tinh sạch cần cải thiện thêm hơn nữa nhằm tăng hiệu suất thu hồi bacteriocin cũng như độ sạch của nó.
3.4.2 . Chương trình tinh sạch trên hệ thống HPLC
Hình 3.6. Sắc ký đồ dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarum UL487 qua cột semi C4-dionex
Chương trình sắc ký HPLC đảo pha được sử dụng cho bước tinh sạch cuối cùng cho bacteriocin từ L. plantarum UL487. Kết quả thu được đỉnh thứ nhất tại
thời gian lưu 7.1 phút với 10% đệm B (acetonitrile) và một đỉnh thứ hai được rửa giải với 25% đệm B (acetonitrile), tương ứng với thời gian lưu 19.50 phút.
Sau khi tinh sạch từ sắc ký HPLC đảo pha bacteriocin chủng L. plantarum UL487
được phân tích bằng LC/MS. Kết quả cho thấy toàn bộ các ion được phát hiện tương ứng với các đỉnh khác nhau trong sắc ký ion tổng số (TIC – total ion chromatogram). Tín hiệu được cho là giống bacteriocin đạt được tại thời gian lưu 15.50 phút. Theo T. Zendo và các cộng sự (2008) các bacteriocin có thể được phát hiện dưới dạng nhiều ion tích điện, kích thước thơng thường của tín hiệu bacteriocin trong phạm vi m/z từ 1000 và 2000 [61]. Tuy nhiên các tín hiệu từ chủng UL487 khơng thể xác định rõ ràng được kích thước của một bacteriocin do lượng peptide thấp.
3.5. Nhân dịng và giải trình tự gen
Phân tích LC/MS và tinh sạch protein cho thấy tồn tại bacteriocin từ chủng L.
plantarum UL487. Chúng tơi tiến hành PCR và giải trình tự một số gen nhằm xác minh
sự hiện diện của bacteriocin. Trong đó, gen pln A nhân tố cảm ứng thuộc operon điều hòa gen và pln EF quy định bacteriocin hai peptide có khả năng kháng khuẩn được
chúng tôi sơ bộ nghiên cứu.
3.5.1. Phát hiện các gen mã hóa cho bacteriocin từ chủng L. plantarum UL487 UL487
Từ chủng vi khuẩn L. plantarum UL487, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA chromosome. Các gen được phân lập bằng phản ứng PCR khuếch đại những đoạn gen mong muốn với trình tự mồi đặc hiệu. Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn hai gen lần lượt là gen pln A, gen pln EF.
Hình 3.7. Kết quả PCR kiểm tra các gen plnA, plnEF thuộc vi khuẩn L.
plantarum UL487 trên agarose 1.5%
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR có kích thước nhỏ hơn 500 bp tương ứng lần lượt với các gen pln A và pln EF. Kết quả PCR này được sử dụng cho kỹ thuật nhân dịng nhằm phân tích rõ hơn các gen mục tiêu.
3.5.2. Nhân dòng các gen trong chủng L. plantarum UL487
Các đoạn DNA thuộc các gen pln A và pln EE tương ứng sau khi khuếch đại được tinh sạch theo kit Bioneer và được thực hiện phản ứng ghép nối vào vector nhân dòng pGEM- T (Promega, USA). Vector tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Các khuẩn lạc dương tính được sàng lọc từ mơi trường đĩa
thạch LB bổ sung ampicillin 25 µL/ml. Các plasmid tái tổ hợp được tiến hành kiểm tra bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi M13 và mồi đặc hiệu cho các đoạn gen để khẳng định q trình ghép nối thành cơng. Kết quả được trình bày trong Hình 3.8.
A B
Hình 3.8. Kết quả PCR sàng lọc khuẩn lạc với mồi M13 và mồi đặc hiệu gen
plnA, plnEF
Kết quả điện di quan sát được trên gel agarose 1.5% chỉ ra: đối với cặp mồi đặc hiệu cho hai gen mục tiêu, các giếng đều xuất hiện một băng. Kích thước băng nhỏ hơn 500 bp tương ứng với kích thước gen pln A và gen pln EF. Đối với cặp mồi M13, sản phẩm PCR cho kết quả một băng DNA có kích thước bao gồm: độ dài của đoạn gen mục tiêu và khoảng 200 bp là độ dài đoạn DNA trên vector. Điều này chứng minh gen mục tiêu được gắn thành cơng vào vector tách dịng. Plasmid tái tổ hợp được tách chiết và giải trình.
3.5.3. Phân tích trình tự các gen và so sánh với các chủng Lactobacillus plantarum khác plantarum khác
Trình tự DNA các gen pln A, pln EF của chủng L. plantarum UL487 được phân tích nhằm kiểm tra chính xác gen đích và so sánh trình tự này với cơ sở dữ liệu trên Genbank sử dụng cơng cụ BLAST (NCBI; http://www.ncbi/nlm.nih.gov/Blast).
Trình tự gen pln A được khuếch đại từ chủng UL487 tương đồng 96.23% với gen plnA của chủng Lactobacillus paraplantarum L-XM1.
pln regulon là đặc trưng trong nhiều chủng L. plantatrum. Các nghiên cứu trên
chủng L. plantarum C11 cho thấy pln regulon được tổ chức thành năm operon. Theo Dzung. B. Diep và cộng sự (2001), peptide PlnA cảm ứng các phiên mã trong năm operon [19]. Nghiên cứu của Sáenz và cộng sự (2009) chỉ ra trong 25 chủng chứa operon điều hịa (plnABCD) có 21 chủng giống nhau về trình tự gen pln A, kể cả vùng promoter. Những trình tự này giống với trình tự pln A được tìm thấy trong L. plantarum C11 và WCFS1 được cơng bố trước đó. Vì thế, trình tự của gen pln A được
bảo tồn cao và peptide (plnA) đóng vai trị quan trọng trong hệ điều hịa [43].
Trong bộ gen L.plantarum UL487, trình tự gen pln EF được khuếch đại từ chủng UL487 tương đồng 99% tương đồng với plantaricin EF của các chủng L.plantarum subsp. plantarum chủng E1.
Gen plnEF nằm trong openron (plnEFI) là một trong ba operon (plnEFI, plnJKLR, plnOPMN) mã hóa peptide giống bacteriocin. Theo Diep và cộng sự
(2009), hoạt tính của peptide EF phụ thuộc vào hoạt động bổ sung của hai peptide E và F [18]. Trong nghiên cứu của Diep và các cộng sự (1996), dưới tác động của peptide A, phiên mã của operon (pln EFI) mạnh nhất trong ba operon [17].
Hình 3.10. So sánh trình tự nucleotide gen plnEF của chủng L. plantarum UL487
Gen pln A từ chủng L. plantarum UL487 tương đồng 96.23% với gen pln A
của chủng Lactobacillus paraplantarum L-XM1 và gen pln EF tương đồng 99% với plataricin EF chủng L.plantarum subsp. plantarum chủng E1.
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu ở trên, chúng tôi đưa ra một số kết luận như sau : 1. Chủng L. plantarumUL487 sinh tổng hợp bacteriocin cao nhất sau 24h
nuôi cấy, ở 30oC trong điều kiện nuôi cấy tĩnh trên môi trường MRS lỏng
2. Bacteriocin của chủng L. plantarum UL487 có phổ kháng khuẩn rộng và hoạt độ khá cao đối với vi khuẩn kiểm định Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM
1157 (3200 AU/ml)
3. Hoạt tính của bacteriocin sinh tổng hợp bởi chủng L. plantarumUL487 bền với nhiệt độ (hoạt tính vẫn giữ 98.93%) trong 60 phút ở điều kiện nhiệt độ 100oC) và có thể hoạt động trong dải pH tương đối rộng (3,9 – 9).
4. Bacteriocin từ chủng L. plantarum UL487 tinh sạch bằng phương pháp sắc ký trao đổi cation trên hệ thống AKTA có độ sạch tăng 5.36 lần so với dịch nuôi cấy thô ban đầu và hiệu suất của quá trình tinh sạch là 14.062%
5. Gen Pln A từ L. plantarum UL487 tương đồng 96.23% với gen pln A của chủng Lactobacillus paraplantarum L-XM1 và gen pln EF tương đồng 99% với plantaricin EF của các chủng L.plantarum subsp. plantarum chủng E1.
KIẾN NGHỊ
Từ những kết quả thí nghiệm đã đạt được, chúng tơi có một số kiến nghị sau nhằm hồn thiện cơng trình nghiên cứu :
- Tối ưu hóa q trình thu nhận và tinh sạch bacteriocin từ chủng L. plantarum UL487 để thu được hàm lượng cao nhất.
- Tiến hành thêm các thí nghiệm nhằm xác định chính xác loại bacteriocin từ chủng L. plantarum UL487.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Nguyễn Thị Hoài Hà,Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim Quy (2002), “Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacterioxin của loài Lactobacillus plantarum
L24”, Tạp chí Di truyền học và ứng dụng, Chuyên san Công nghệ sinh học, Hà Nội , tr. 47 - 52.
2. Nguyễn Thúy Hương, Trần Thị Tưởng An (2008), “Thu nhận bacteriocin bằng phương pháp lên men bởi tế bào Lactococcus lactic cố định trên chất mang
Cellulose vi khuẩn (BC) và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu”, Science & Technology Development, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ
Chí Minh, 11 (9), tr. 100 – 109.
3. Phạm Thùy Linh (2011), Nghiên cứ u khả năng tạo chất diê ̣t khuẩn enterocin P tá i tổ hợp nhằm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm,Luận án Tiến sĩ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội.
4. Tổng cục Tiêu chuẩn - Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường (2016), Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6261 : 1997.
5. Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Vũ Tường Vy, Trần Thu Hoa (2007),“Khảo sát khả năng chịu đựng muối mật và kháng sinh của một số vi sinh vật là nguyên liệu sản xuất probiotic đường uống”, Tạp chí Dược học, 378.
6. Lê Thị Hồng Tuyết, Hoàng Quốc Khánh (2004),“Một sốđặc tính của bacteriocin sản xuất bởi vi khuẩn Lactobacillus acidophilus”, Báo cáo Khoa học, Viện Sinh học Nhiệt Ðới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Tiếng Anh
7. Ali W. S., Musleh R. M. (2015),"Purification and Characterization of PlantaricinVGW8, A Bacteriocin Produced by Lactobacillus PlantarumVGW8",Journal of Biology, Agriculture and Healthcare, 5 (1), pp. 147 - 152
8. Bradford M. M. (1976),"A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye
9. Bromberg R., Moreno I., Zaganini C. L., Delboni R. R., Oliveira J. D. (2004), "Isolation of bacteriocin-producing lactic acid bacteria from meat and meat products and its spectrum of inhibitory activity",Brazilian Journal of
Microbiology, 35 (1), pp. 1678 – 4405.
10. Crupper S. S., Iandolo J. J. (1996), "Purification and partial characterization of a novel antibacterial agent (Bac1829) produced by Staphylococcus aureus
KSI1829", Applied and Environmental Microbiology , 62 (9), pp. 3171–3175.
11. Chen H., Hoover D. (2003),"Bacteriocins and their FoodApplications",Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2 (3), pp. 82 - 100
12. Daeschel M. A., McKenney M. C., McDonald L. C. (1990), "Bacteriocidal activity of Lactobacillus plantarum C-11", Food Fermentation, 7, pp. 91 - 98.
13. Desriac F., Defer D., Bourgougnon N., Brillet B., Chevalier P. L., Fleury Y. (2010), "Bacteriocin as Weapons in the Marine Animal-Associated Bacteria Warfare: Inventory and Potential Applications as an Aquaculture Probiotic",
Marine Drugs, 8 (4), pp. 1153 – 1177.
14. De Vuyst L., Leroy F. (2007), “Bacteriocin from lactic acid bacteria: Production, purification and food applications”, J Mol Microbiol Biotechnol, 13, pp. 194-199
15. Des.F, Paul.C, Colin. H, Paul. R (2007), “Bacteriocin biosynthesis, structure, and function”, Research and Applications in Bacteriocins, chapter 2, pp.5-40.
16. Díaz R. J., Barba J. L., Cathcart D. P., Holo H., Nes I. F., Sletten K. H. (1995), "Purification and Partial Amino Acid Sequence of Plantaricin S, a Bacteriocin Produced by Lactobacillus plantarum LPCO10, the Activity of Which Depends on the Complementary Action of Two Peptides",American Society for
Microbiology, 61 (12), pp. 4459 – 4463.
17. Diep.D.B (1996), “Characterization of the Locus Responsible for the Bacteriocin Production in Lactobacillus plantarum C11”, Applied and Evironmental microbiology, pp. 4472-4483.
18. Diep.D.B (1998), “Antagonistic Activity of Lactobacillus plantarum C11: Two
New Two-Peptide Bacteriocins, Plantaricins EF and JK, and the Induction Factor Plantaricin A” Applied and Evironmental microbiology, pp. 2269-2272. 19. Diep.D.B (2009), “An overview of the mosaic bacteriocin pln loci from
Lactobacillus plantarum”, pp. 1562-1574.
20. Diep.D.B (2009), “ Inducible bacteriocin production in Lactobacilus is regulated by differential expression of the pln operons and by two antagonizing response regulators, the activity of which is enhanced upon phosphorylation”, Molecular Microbiology, 47(2), 483-494.
21. E.Abo-Amer A. (2007), “Characterization of a Bacteriocin-Like Inhibitory Substance Produced by Lactobacillus plantarum Isolated from Egyptian Home- Made Yogurt”, ScienceAsia, 33, pp. 313-319.
22. El-Shafie H. A., I.Yahia N., Ali H. A., Khalil F. A., El-Kady E. M. (2009), "Hypocholesterolemic Action of Lactobacillus plantarum NRRL-B-4524 and Lactobacillus paracasei in Mice with Hypercholesterolemia Induced by Diet",Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 3 (1), pp. 218 – 228..
23. Finkelstein R. A. (1996), “Chapter 24 Cholera, Vibrio cholerae O1 and O139,
and Other Pathogenic Vibrios”, Medical Microbiology (4th ed.).
24. Hayek A. S., Ibrahim A. S. (2013), "Current Limitations and Challenges with Lactic Acid Bacteria: A Review", Food and Nutrition Sciences, 4, pp. 73 - 87. 25. Hashium A. J., Hamza S. J., Aldujaili N. H. (2010), "Antimicrobial Activity of
Bacteriocin Produced by Weissella cibaria NRIC0136", Al-Kufa Journal for Biology, 2 (1).
26. Héchard Y., Sahl H.-G. (2002), "Mode of action of modified and unmodified bacteriocins from Gram-positive bacteria", Biochimie , pp. 545 - 557.
27. Hu M., Dang L., Zhao H., Zhang C., Lu Y., Yu J. (2016), "Characterization and Antibacterial Mode of a Novel Bacteriocin with Seven Amino Acids from
28. Ibrahim O. O., Day D. F. (2014), "Biotechnology in Nutrition and Food Engineering", Journal of Nutritional Health & Food Engineering, 1 (5).
29. Joerger MC, Klaenhammer TR (1986). “Characterization and purification of helveticin J and evidence for a chromosomally determined bacteriocin produced by Lactobacillus helveticus 481”. J.Bacteriol, 1986 Aug167(2):439-46.
30. Juan C. Oscáriz, Antonio G. Pisabarro (2001). “Classification and mode of action of membrane-active bacteriocin produced by gram positive bacteria”. Int. Microbiol (2001) 4: 13-19, DOI 10.1007/s101230100003, published online 25 August 2001.
31. Klaenhammer T. R., Buck B. L, Azcarate. M. A (2005), “Genomic features of lactic acid bacteria effecting bioprocessing and health”, FEMS Microbiology Reviews, vol 3, pp, 393-409.
32. Klaenhammer, T.R, (2006), “Comparative genomics of the lactic acid
bacteria”, Proceedings of the National Academy of Science of the United States
of America, vol 103, pp.15611-15616.
33. Klaenhammer, T.R, (2007), “The genomics of lactic acid bacteria”, DOI:10.1016/j.tim.2007.09.010, vol15, pp.546-554.
34. Klaenhammer, T.R, (2009), “Genomic features of Lactobacillus species”,
Frontiers in Bioscience 14, pp.1362-1386
35. Kumar R. S., Arul V. (2009), "Purification and characterization of phocaecin PI80: an anti-listerial bacteriocin produced by Streptococcus phocae PI80
Isolated from the gut of Peneaus indicus (Indian white shrimp)", J Microbiol Biotechnol , 19 (11), pp. 1393 – 1400.
36. Liu.W, Zhang.H, Pag.H, Cai.Y (2014), “Biodiversity of Lactic Acid Bacteria”,
Lactic Acid Bacteria, chapter 2, pp.103-203.
37. Lalanne.M.G. (2012), “Lactobacillus plantarum: An overview with emphasis in biochemical and healthy properties”, Lactobacillus: classification, uses and
38. Mahawar B. P. (2012), "Multilocus sequence typing for differentiation of closely related species of indigenous probiotic Lactobacilli",Master science in Dairy Microbiology, Nation Dairy Research Institute , pp. 30 - 31.
39. Müller D. M., Carrasco M. S., Tonarelli G. G., Simonetta A. C. (2009),