CHƢƠNG 2 .NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1 Định tính các nhóm chất của lồi Bán hạ roi
Chúng tôi đã áp dụng các phƣơng pháp theo tài liệu tham khảo[1].
Phản ứng định tính glycosid tim
Cân 5g bột dƣợc liệu cho vào bình nón dung tích 250ml. Thêm 100ml ethanol 25% rồi ngâm trong 24 giờ. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100ml. Thêm vài ml chì acetat 30%, khuấy đều. Để lắng, lọc dịch vào một cốc có mỏ dung tích 100ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm tiếp chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc khơng cịn tủa với chì acetat.
Chuyển dịch lọc vào một bình gạn dung tích 100ml. Lắc dịch chiết với hỗn hợp cloroform / ethanol (4:1), lắc 2 lần, mỗi lần 8ml. Gạn lớp dịch chiết cloroform trong ethanol vào một cốc có mỏ đã đƣợc sấy khơ.
Gộp các dịch chiết cloroform và loại nƣớc bằng natri sulfat khan. Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm nhỏ đã đƣợc sấy khô. Đem cô cách thủy đến khô. Cắn thu đƣợc đem tiến hành làm các phản ứng định tính.
Phản ứng Liebermann – Burchardt
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống 450. Thêm từ từ theo thành ống 0,5ml axit sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Kết quả: Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vịng màu tím đỏ (phản ứng dƣơng tính).
Phản ứng Baljet
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (1 phần dung dịch axit picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%). So sánh màu sắc với ống chứng là ống khơng có cắn glycosid tim. Kết quả: Ống thử có màu đỏ cam không đậm hơn ống chứng (phản ứng âm tính).
Phản ứng Legal
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều sẽ xuất hiện màu đỏ cam. So sánh màu sắc với ống chứng là ống khơng có cắn glycoside. Kết quả: Ống thử có màu đỏ cam không đậm hơn ống chứng – phản ứng âm tính.
Phản ứng Keller – Kiliani
Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong axit acetic. Lắc đều và cho từ từ theo thành ống 0,5ml axit sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Kết quả: Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vịng màu đỏ tím – phản ứng dƣơng tính.
Định tính saponin trong dƣợc liệu
Cho 1g bột dƣợc liệu vào ống nghiệm lớn. Thêm 10ml nƣớc. Lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 5 phút. Để yên và quan sát hiện tƣợng tạo bọt.
Kết quả: Xuất hiện cột bọt không bền sau khi ngừng lắc 45 phút – phản ứng âm tính.
Định tính tanin
Tiến hành: Cho 2g bột dƣợc liệu vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nƣớc cất. Đun sôi trực tiếp 5 phút. Lọc qua giấy lọc gấp nếp. Lấy dịch lọc chia làm 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml, đem làm các phản ứng định tính.
Phản ứng với protein
Ống nghiệm 1: Thêm vào 1 giọt dung dịch gelatin 1% mới pha. Kết quả: Ống nghiệm không xuất hiện kết tủa bông trắng – phản ứng âm tính.
Phản ứng với ion kim loại nặng
Ống nghiệm 2: Thêm vào vài giọt FeCl3 5%. Kết quả: Ống nghiệm không xuất hiện kết tủa xanh đen – phản ứng âm tính.
Ống nghiệm 3: Thêm vào vài giọt chì acetat 10%. Kết quả: Ống nghiệm xuất hiện kết tủa bơng – phản ứng dƣơng tính.
Định tính đƣờng khử
Cân khoảng 2g bột dƣợc liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nƣớc cất, đun sôi vài phút. Lọc qua giấy lọc vào 1 ống nghiệm khác. Thêm 2ml dung dịch thuốc thử Felling. Đun cách thủy sôi vài phút.
Kết quả: Ống nghiệm xuất hiện kết tủa đỏ gạch – phản ứng dƣơng tính.
Định tính polysaccharid
Lấy 2g bột dƣợc liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nƣớc cất. Đun sôi cách thủy vài phút. Lọc lấy dịch. Cho vào 3 ống nghiệm:
Ống 1: 4ml dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Lugol. Ống 2: 4ml nƣớc cất + 5 giọt thuốc thử Lugol. Ống 3: 4ml dịch chiết.
Kết quả: Màu của ống 1 nhạt hơn màu ống 2, màu ống 2 nhạt hơn ống 3 – phản ứng âm tính.
Định tính axit amin
Lấy 2g bột dƣợc liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nƣớc cất, đun sôi vài phút. Lọc qua giấy lọc vào 1 ống nghiệm khác. Thêm vài giọt thuốc thử
Ninhydrin 3%. Đun cách thủy sôi vài phút. Kết quả: Ống nghiệm xuất hiện màu xanh – phản ứng dƣơng tính.
Định tính axit hữu cơ
Cho 2g bột dƣợc liệu vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nƣớc cất. Đun sôi trực tiếp vài phút trên ngọn lửa đèn cồn. Để nguội và lọc. Thêm vào dịch lọc một ít bột Na2CO3.
Kết quả: Ống nghiệm xuất hiện bọt khí CO2 bay lên – phản ứng dƣơng tính.
Định tính flavonoid
Lấy 2g bột dƣợc liệu cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 20ml ethanol 90%. Đun cách thủy sôi trong vài phút. Lọc nóng. Dịch chiết đem tiến hành các phản ứng định tính.
Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda)
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm một ít bột magnesi kim loại (khoảng 10mg). Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5 giọt). Để yên một vài phút. Kết quả: Dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ – phản ứng dƣơng tính.
Phản ứng với kiềm
Bƣớc 1: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ. Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% sau đó thêm 1ml nƣớc cất. Kết quả: Ống nghiệm xuất hiện tủa vàng.
Bƣớc 2: Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọamoniac đặc đã đƣợc mở nút. Nhỏ một giọt khác lên giấy lọc để so sánh. Kết quả: Màu vàng của vết dịch chiết tăng lên – phản ứng dƣơng tính.
Phản ứng với FeCl3
Tiến hành: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%. Kết quả: Xuất hiện kết tủa xanh đậm (phản ứng dƣơng tính).
Phản ứng diazo hóa
Tiến hành: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (dung dịch NaOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều, đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút. Kết quả: Xuất hiện màu đỏ – phản ứng dƣơng tính.
Định tính alkaloid
Cân 5g bột từ cây bán hạ roi, cho vào bình nón dung tích 50ml, thấm ẩm bằng dung dịch ammoniac đặc. Đậy kín để khoảng 30 phút. Cho 15ml chloroform lắc đều trong 1h. Lọc lấy dịch chiết cho vào bình gạn. Sau đó lắc kỹ 2 lần, mỗi lần với 10ml dung dịch H2SO4 1N. Để phân lớp, gạn lấy dịch chiết axit, chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 - 3 giọt lần lƣợt các thuốc thử sau:
− Ống 1: Thuốc thử Mayer.
Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng – phản ứng dƣơng tính. − Ống 2: thuốc thử Bouchardat.
Kết quả: Xuất hiện kết tủa nâu – phản ứng dƣơng tính. − Ống 3: Thuốc thử Dragendorff.
Kết quả: Xuất hiện kết tủa đỏ cam – phản ứng âm tính.
Định tính chất béo, steroid
Tiến hành: Lấy 5g bột dƣợc liệu vào bình nón dung tích 50ml, đổ ngập ether dầu hỏa, bọc kín, ngâm 24 giờ. Lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc. Chia dịch lọc làm 3 phần để định tính nhƣ sau:
Định tính chất béo
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên mảnh giấy trắng, sấy nhẹ cho bay hết hơi dung môi. Kết quả: Để lại vết mờ trên giấy – phản ứng dƣơng tính.
Định tính steroid
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, cô cách thủy đến cắn. Thêm vào ống nghiệm khoảng 1ml anhydrid acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn. Để nghiêng ống nghiệm 450, thêm từ từ H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm.
Kết quả: Mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng có vịng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá – phản ứng dƣơng tính.