3.4.1. Chất TF1
Chất TF1 là chất rắn kết tinh, có nhiệt độ nóng chảy ở 152-155oC.
− Phổ hồng ngoại của chất TF1 cho đỉnh hấp thụ của nhóm carbonyl liên hợp (1678 cm-1).
− Phổ 1H-NMR (Hình 3.4; 3.5 và 3.6) cho thấy có hai nhóm metyl với các tín hiệu singlet tại δH = 0,71 (3H, s, CH3-18) và δH = 1,18 (3H, s, CH3-19), ba nhóm metyl gắn với –CH với các tín hiệu doublet tại: δH = 0,82 (3H, d, J = 6,7 Hz, CH3- 26); 0,84 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-27), 0,86 (3H, d, J = 7,4 Hz, CH3-21) và nhóm metyl gắn với –CH2 với tín hiệu triplet tại : δH = 0,92 (3H, t, J = 6,3 Hz, H-29).
− Sự có mặt của nhóm carbonyl liên hợp cũng đƣợc thấy rõ trong phổ 13C- NMR (Hình 3.6) với các tín hiệu δC =199,598 (s, C-3), 171,653 (s, C-5) và 123,754 (d, C-4) cũng nhƣ tín hiệu δH = 5,72 (1H, br s, H-4). Cặn DCM (8,5g) D2 (1,5g) D3 (1g) D1 (0,5g) D4 (1,2g) D5 (0,8g) CC, Sillica gel n-hexane- DCM TF1(20mg) TF2 (15mg) CC, Sillica gel n-hexane- DCM
− Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của chất TF1 (Hình 3.7)có tín hiệu của 29 nguyên tử carbon, trong đó có 6 nhóm CH3, 11 nhóm CH2, 8 nhóm CH và 4 ngun tử carbon bậc 4.
Hình 3.5 Phổ 1
H-NMR dãn rộng của chất TF1 (Stigmast-4-en-3-one)
Hình 3.6 Phổ 1H-NMR dãn rộng của chất TF1 (Stigmast-4-en-3-one)
Hình 3.7 Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của chất TF1
Phổ 1H- và 13C-NMR của chất TF1 hoàn toàn phù hợp với phổ của stigmast- 4-en-3-one [14] (Bảng 3.7). Do đó, TF1 là stigmast-4-en-3-one (Hình 3.8) .
Bảng 3.7 Số liệu phổ 1 H- và 13C-NMR của hợp chất TF1 và Stigmast-4-en-3-one STT Chất TF1 Stigmast-4-en-3-one δC δH(J=Hz) δC δH(J=Hz) 1 35,7 34,8 2 34,0 2,26 (1H, ddd, J=2.4, 3.9, 14.5 Hz, H-2A) 32,8 3 199, 6 198,5 4 123, 8 5,72 (1H,br.s, H-4) 122,7 5,72 (1H, s, H-4) 5 171, 7 170,5 6 33,0 31,9 7 32,1 31,0 8 35,7 34,6 9 53,9 52,7 10 38,6 37,5 11 23,1 22,0 12 39,7 38,5 13 42,4 41,3 14 55,9 54,9 15 26,2 25,0 16 28,2 27,1 17 56,1 54,9 18 12,0 0,71 (3H, s, CH3-18) 10,9 0,71(3H, s, H-18) 19 19,1 1,18 (3H, s, CH3-19) 18,0 1,18(3H, s, H-19) 20 36,1 35,0 21 17,4 0,86 (3H, d, J=7,4 Hz, CH3-21) 16,3 0,84 (3H, d, 7,4Hz, H-21) 22 33,9 32,9 23 24,2 23,1 24 45,9 44,7 25 29,2 27,1 26 19,8 0,82 (3H, d, J=6,7 Hz, CH3-26) 18,7 0,82 (3H, d, 6,7Hz, H-26) 27 18,7 0,84 (3H, d, J=7,0 Hz, CH3-27) 17,6 0,84 (3H, d, 7,0Hz, H-27) 28 24,2 23,1 29 12,0 0,92 (3H, t, J=6,3 Hz, CH3 -29) 10,9 0,92(3H, t, J=6,4Hz, H-29)
Hình 3.8Cơng thức cấu tạo của chất TF1
Stigmast-4-en-3-one có thể làm hạ đƣờng huyết để điều trị tiểu đƣờng type II. Trong nghiên cứu của Abildgaard và cộng sự (2003) [5], stigmast-4-en-3-one là ngun liệu quan trọng trong sản xuất các hc mơn tổng hợp và đƣợc sử dụng nhƣ chất làm mềm trong các sản phẩm giấy.
3.4.2 Chất TF2
Chất TF2 thu đƣợc dƣới dạng tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy ở 155-157oC.
Trên phổ ESI-MS của chất TF2 xuất hiện pic ion tại 395,3 [M -H2O+H]+ phù hợp với cơng thức phân tử là C29H48O. Phổ 1H-NMR (hình 3.9) thấy xuất hiện tín hiệu của 2 nhóm methyl bậc ba tại δH 0,84 (s), 1,03 (s); 3 nhóm methyl bậc hai tại δH 0,91 (d, J = 6,5 Hz), 0,81 (d, J = 6,8 Hz), δH 0,86 (3H, d, J = 9,5 Hz) và 1 nhóm thế methyl bậc một tại δH 0,84 (t, J = 8,5 Hz). Trên phổ xác nhận sự có mặt của nhóm β-OH (δH 3,53, m, H-3) tại C-3. Trên phổ cũng xác nhận sự có mặt của liên đơi tại δH 5,32 (br s) và một liên kết đôi trans khác tại δH 5,15 (dd, 8,5, 15,0)/ 5,02 (dd, 8,5, 15,0).
Phổ 13C-NMR và phổ DEPT (hình 3.10 và hình 3.11) của TF2 xuất hiện 29 tín hiệu cacbon, gồm có 3 cacbon bậc bốn, 11 nhóm methine, 9 nhóm methylen và 6 nhóm methyl đặc trƣng của một khung sterol. Đặc biệt, tín hiệu của hai cặp olefin
đƣợc xác nhận tại C-5 (δC 140,75)/C-6 (δC 121,73) và C-22 (δC 138,33)/C-23(δC 129,27).
Dựa vào các phân tích trên (bảng 3.8 và các hình từ 3.9 đến hình 3.11) và kết hợp so sánh số liệu phổ 13C-NMR của TF2 với các số liệu đã đƣợc công bố của stigmasterol thấy hoàn toàn phù hợp. Nhƣ vậy, chất TF2 đƣợc khẳng định là stigmasterol (hình 3.12).
Bảng 3.8 Số liệu phổ NMR của TF2 và hợp chất tham khảo C #δC δC DEPT δH(J = Hz) C #δC δC DEPT δH(J = Hz) 1 37,21 37,25 CH2 2 31,62 31,66 CH2 3 71,81 71,81 CH 3,53 (m) 4 42,29 42,30 CH2 5 140,72 140,75 C 6 121,71 121,73 CH 5,35 (br d, 3,5) 7 31,87 31,90 CH2 8 31,87 31,90 CH 9 50,08 50,15 CH 10 36,48 36,51 C 11 21,07 21,09 CH2 12 39,64 39,77 CH2 13 42,29 42,30 C 14 56,83 56,87 CH 15 24,34 24,37 CH2 16 28,92 28,93 CH2 17 55,90 56,05 CH 18 12,03 11,99 CH3 0,84 (s) 19 19,38 19,41 CH3 1,03 (s) 20 40,50 40,51 CH 21 21,05 21,22 CH3 0,91 (d, 6,5) 22 138,32 138,33 CH 5,15 (dd, 8,5, 15,0) 23 129,22 129,27 CH 5,02 (dd, 8,5, 15,0) 24 51,21 51,24 CH 25 31,87 31,90 CH 26 21,20 21,22 CH3 0,84 (t, 8,5) 27 25,40 25,41 CH2 28 18,95 19,04 CH3 0,81 (d, 6,8) 29 12,25 12,26 CH3 0,86 (d, 9,5)
Hình 3.11 Phổ DEPT của chất TF2
Hình 3.12 Cấu trúc hóa học của hợp chất TF2 là stigmasterol
3.5. Đánh giá hoạt tính sinh học các chất phân lập đƣợc từ cây bán hạ roi 3.5.1. Hoạt tính chống oxy hố của các chất phân lập đƣợc 3.5.1. Hoạt tính chống oxy hố của các chất phân lập đƣợc
Kết quả thử nghiệm hoạt tính tới gốc tự do DPPH của các chất phân lập từ cây bán hạ roi đƣợc trình bày ở Bảng 3.9.
Bảng 3.9 Kết quả thƣ̉ hoa ̣t tính chống oxy hoá của các chất phân lập
chất thử Giá trị EC50 (µg/ml) trên hệ DPPH
TF1 >128
TF2 >128
Đối chứng dƣơng Quercetin 8,11
Kết quả ở bảng 3.9 cho thấy hai chất sạch TF1 và TF2 phân lập đƣợc từ cây Bán hạ roi khơng có hoạt tính oxy hóa trên hệ thử này khi các giá trị EC50tƣơng ứng trên hệ DPPH đều >128µg/ml.
3.5.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn dịch chiết
Bảng 3.10 Hoạt tính ức chế phát triển tế bào của các chất phân lập từ Bán hạ roi
STT Tên chất Giá trị IC50 (µg/ml) với các dịng tế bào MCF7 (ung thƣ vú) KB (ung thƣ biểu mô) HepG2 (ung thƣ gan) Lu (ung thƣ phổi) 1 TF1 <128 <128 <128 <128 2 TF2 <128 <128 <128 <128 3 Ellipticine 0,53 0,45 0,63 0,38
Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy các chất phân lập đƣợc từ cây bán hạ roi khơng thể hiện hoạt tính kháng các dịng tế bào ung thƣ KB, Hep - G2, Lu, MCF7 trên hệ thử này ở nồng độ <128µg/ml.
3.5.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định củ a các phân đoa ̣n di ̣ch chiết t ừ Bán hạ roi Bán hạ roi
Bảng 3.11 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chất phân lập Bán hạ roi
STT Tên mẫu
Đƣờng kính vơ khuẩn (mm)
Vi khuẩn Gram Vi khuẩn Gram Nấm men
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)
1 TF1 0 0 0 0 0 0 0
2 TF2 0 0 0 0 0 0 0
Chú thích: (1) Staphylococus areus, (2) Bacillus subtilis, (3) Latobacillus
fermentum,(4)Samonella enterica, (5) Escherichia coli, (6)Pseudomonas
aeruginosa, (7) Candida albican
Từ kết quả ở bảng 3.11 cho thấy các chất phân lập từ cây bán hạ roi khơng có hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật kiểm định trên hệ thử này khi khơng có xuất hiện đƣờng kính của vịng kháng khuẩn
KẾT LUẬN
1- Đã xác định dịch chiết Bán hạ roi không chứa các thành phần glycoside,
sapponin, tannin, polysacharide; nhƣng chứa đƣờng khử, axit amin, axit hữu cơ, flavonoid, alkaloid, chất béo và steroid.
2- Đã xác định dịch chiết Ethyl acetate từ Bán hạ roi có khả năng chống oxi
hóa, trong khi dịch chiết Dichoromethane của Bán hạ roi có tác dụng kìm hãm tế bào ung thƣ.
3- Đã phân lậpvà xác định 2 hợp chất từ dịch chiết của Bán hạ roi gồm: chất
TF1 là stigmast-4-en-3-one và TF2 là stigmasterol.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục phân lập các hợp chất tinh khiết của bán hạ roi từ các dịch chiết cịn lại để xác định các hoạt chất có hoạt tính kháng khuẩn, chống oxi hóa.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
1. Bộ môn dƣợc liệu (2007), Thực tập dược liệu – Phần kiểm nghiệm bằng phương pháp hóa học, Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội.
2. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học.
3. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, NXB Y học.
4. Nguyễn Khắc Hồng (2008), Nghiên cứu thành phần hóa học của cây bán hạ
ba thùy (Typhonium trilobatum, Araceae), Luận văn thạc sĩ hóa học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Thái Nguyên.
Tài liệu Tiếng Anh
5. Abildgaard A., Mikkelsen S. H., Stuer-LauridsenF. (2003), “Survey of Chemical substances in Paper handkerchiefs and Toilet paper”, Survey of Chemical Substances in Consumer Products, 34, pp. 1–65.
6. Azwanida, N.N. (2015), “A review on the extraction methods use in medicinal plants, principle, strength and limitation”, Med Aromat Plants, 4(3), pp.
1–6.
7. Choon-Sheen Lai., Rosemal H.M.H. Mas., Nair N. K., Majid M. I. A., Mansor S. M., Navaratnam V. (2008), “T. flagelliforme inhibits cancer cell growth
in vitro and induces apoptosis: An evaluation by the bioactivity guided approach”, Journal of Ethnopharmacology,118, pp. 14–20.
8. Choon S. L., Rosemal H.M.H. Mas., Nair N. K., Mansor S. M., Navaratnam V. (2010), “Chemical constituents and in vitro anticancer activity of T. flagelliforme (Araceae)”, Journal of Ethnopharmacology, 127, pp. 486–494.
9. Farida Y., Wahyudi P. S., Wahono S., Hanafi M. (2012), “Flavonoid glycoside from the ethyl acetate extract of Keladi tikus T. flagelliforme (Lodd) Blume leaves”, Asian Journal of natural & Applied sciences, 1(4), pp. 16–21.
10. Farida Y., Irpan K., Fithriani L. (2014), “Antibacterial and antioxidant activity of Keladi tikus leaves extract (T. flagelliforme) (Lodd) Blume”, Procedia Chemistry, 13 , pp. 209–213.
11. Khanbabaee K., Ree T. V. (2001), “Tannins: Classification and definition”,
Nat. Prod. Rep., 18, pp. 641–649.
12. King T. C., Wong T. Y., Cheng I. W., Huang Y. W., Lin Y. (1998), “Tannins and human health: A review”, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, pp. 421–464.
13. Kumar S., Pandey A. K. (2013), “Chemistry and biological activities of flavonoids: An overview”, The Scientists World Journal, pp. 1–16.
14. Liew, S. Y. (2014) “Studies on chemical constituents and biological
activities of Nauclea Offcinalis and Nauclea Subdita”, Thesis submitted in fulfilment of the requirements for the degree of doctor of Philosophy, University of
Malaya.
15. Maarten J. M., Christenhusz., James W. B. (2016), “The number of known plants species in the world and its annual increase”, Phytotaxa, 261(3), pp. 201–
217.
16. Mankaran S., Dinesh K., Deepak S., Gurmeet S. (2013), “T. flagelliforme: A multipurpose plant”, Int. Res. J. Pharm.,4(3),pp.45–48.
17. Mohan S., Abdul A.B., Abdelwahab S., Al-Zubairi A. S., Sukari M. A., Abdullah R., Taha M. M. E., Ibrahim M. Y., Syam S., (2010), “T. flagelliforme induces apoptosis in CEMss cells via activation of caspase-9, PARP cleavage and cytochrome c release: Its activation coupled with G0/G1 phase cell cycle arrest”, Journal of Ethnopharmacology, 131, pp. 592–600.
18. Nobakht G. M., Kadir M. A., Stanslas J., Charng C. W. (2014), “Cytotoxic effect of T. flagelliforme extract”, Journal of Medicinal Plant Research, 8(31), pp.
1021–1024.
19. Nussey S., Whitehead S. (2001), “Endocrinology: An integrated approach”, Oxford: Bios Scientific Publishers.
20. Purwaningsih E., Widayanti E., Suciati Y. (2014), “Cytotoxicity assay of T.
flagelliforme Lodd against breast and cervical cancer cells”, Universa medicina,
33(2), pp. 75–82.
21. Rezali N. I., Sidik N.J., Saleh A., Osman N. I., Adam N.A., (2017), “The effects of different strength of MS media in solid and liquid media on in vitro
growth of T. flagelliforme”, Asian Pac J Trop Biomed, 7(2), pp. 151–156.
22. Saswati R., Dutta C. M., Paul S. B. (2013), “Antibacterial activity of Aracea: An overview”, Int. Res. J. Pharm , 4 (1), pp. 15–17.
23. Setiawati A., Immanuel H., Utami M. T. (2016), “The inhibition of T. flagelliforme Lodd. Blume leaf extract on COX-2 expression of WiDr colon
cancer cells”, Asian Pac J Trop Biomed , 6 (3), pp. 251–255.
24. Sharma V., Janmeda P. (2017), “Extraction, isolation and identification of flavonoid from Euphorbia neriifolia leaves”, Arabian Journal of Chemistry, 10, pp. 509–514.
25. Sianipar N. F., Maarisi W.,Valencia A. (2013),“Toxic activities of hexane extract and column chromatography fractions of rodent tuber plant (T. flagelliforme Lodd.) on Artemia salina”, Indones. J. Agric. Sci, 14(1) , pp. 1–6.
26. Sianipar N. F., Ariandana., Maarisit W. (2015), “Detection of gamma- irradiated mutant of Rodent tuber (T. flagelliforme Lodd.) in vitro culture by RAPD molecular marker”, Procedia Chemistry,14 (3), pp 285–294.
27. Sianipar N. F., Purnamaningsih R., Darwati I., Laurent D., Chelen. (2015), “The effects of gamma irradiation and somaclonal variation on morphology variation of mutant Rodent tuber (T. flagelliforme Lodd.) lines”, ISSN 2413-0877, 2, pp. 637–645.
28. Sianipar N. F., Laurent D., PurnamaningsihR., Darwati I. (2015), “Genetic variation of the first generation of Rodent tuber (T. flagelliforme Lodd.) mutants based on RAPD molecular markers”, HAYATI Journal of Biosciences, 22(2), pp.
29. SianiparN. F., Purnamaningsih R., Gumanti D. L., Rosaria., Vidianty M. (2017), “Analysis of gamma irradiated-third generation mutants of Rodent tuber (T.
flagelliforme Lodd.) based on morphology, RAPD and GC-MS markers”, Pertanika J. Trop. Agric. Sci., 40(1), pp. 185–202.
30. Singh B., Singh J. P., Singh N., Kaur A. (2017), “Saponins in pulses and their health promoting activities: A review”, Food Chemistry, 233, pp. 540–549.
Website
31. http://cancers-treatment.blogspot.com/ 32. https://www.britannica.com/science/alkaloid