CHƢƠNG 2 .NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.2 Phƣơng pháp chiết mẫu
Bột bán hạ roi(Hình 2.1) đƣợc ngâm trong ethanol (với 80 g bột dƣợc liệu) và methanol (với 2 kg bột dƣợc liệu) ở nhiệt độ phòng trong vòng 4 - 6 ngày. Sau 4 - 6 ngày, hỗn hợp đƣợc lọc qua giấy lọc; và máy cô quay đƣợc sử dụng để thu cặn ethanol và methanol khô.
Cặn ethanol (methanol) khơ đƣợc đem đi cân, hịa tan trong nƣớc và lần lƣợt chiết với các dung môi nhƣ n-hexane, ethyl acetate, methanol, dichloromethane với chu trình tƣơng tự nhƣ ngâm bán hạ roitrong ethanol và methanol để thu đƣợc cao n-hexane, ethyl acetate, methanol và dichloromethane.
Các dung môi trên đƣợc loại bỏ thơng qua chu trình cơ quay. Cặn và cao đƣợc làm khơ và cân. Tồn bộ chu trình ngâm chiết mẫu đƣợc thể hiện ở Hình 2.2.
Hình 2.2 Quy trình ngâm chiết Bán hạ roi [3] 2.4.3 Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học 2.4.3 Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học
3 loại cao chiết với MetOH là : n-hexane, EA, DCM đƣợc dùng để thử hoạt tính sinh học.
2.4.3.1 Phương pháp thử hoạt tính DPPH
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do đƣợc dùng để thực hiện mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, đƣợc xác định bằng cách đo quang ở bƣớc sóng = 517 nm.
Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1mM trong MetOH. Chất thử đƣợc pha trong DMSO 100% sao cho nồng độ cuối cùng đạt đƣợc một dãy các nồng độ 128; 32; 8; 2; 0,5 g/ml. Để thời gian phản ứng 30 phút ở 37oC, đọc mật độ hấp phụ của DPPH chƣa phản ứng bằng máy đọc Genios Tecan ở bƣớc sóng 517 nm. % quét gốc tự do DPPH của mẫu thử đƣợc tính theo cơng thức sau:
SC% = (OD trắng – OD mẫu thử)/ ODtrắng (%).
EC50 đƣợc tính theo giá trị SC tƣơng quan với các nồng độ khác nhau của chất thử, thí nghiệm đƣợc lặp lại với n = 3.
Quercetin là chất tham khảo.
Hình 2.3 Đƣờng chuẩn biểu thị mối tƣơng quan giữa nồng độ DPPH và mật độ quang học [1]
2.4.3.2 Phương pháp thử độ độc tế bào
Các dịch chiết đƣợc tiến hành thử nghiệm trên 3 dòng tế bào ung thƣ: KB, Hep-G2, và Lu đƣợc cung cấp bởi ATCC. Phƣơng pháp thử độ độc tế bào in vitro
đƣợc Viện Ung thƣ Quốc gia Hoa kỳ (NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thƣ ở điều kiện in vitro.
Các dòng tế bào ung thƣ nghiên cứu đƣợc nuôi cấy trong các môi trƣờng nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phơi bị (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37oC; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dịng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha log sẽ đƣợc sử dụng để thử độc tính.
Đồ thị tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ DPPH
y = 0.3225x + 0.0241 R2 = 0.9938 0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000 1.2000 1.4000 1.6000 1.8000 0.0000 1.0000 2.0000 3.0000 4.0000 5.0000 6.0000 Nồng độ DPPH mM M ật đ ộ q u an g h ọ c (O D )
Quy trình thử độ độc:
− 200l dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 × 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong mơi trƣờng DMEM cho các dịng tế bào HepG2, MCF7, KB, LU. Mẫu thử đƣợc pha loãng sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128 g/ml;
32g/ml; 8g/ml; 2g/ml; 0,5g/ml. Ủ 37oC, 5% CO2 trong 3 ngày.
− Đối chứng dƣơng gồm 200 l dung dịch tế bào 3x104 tế bào/ml, đối chứng âm gồm 200l môi trƣờng nuôi cấy.
− Sau 3 ngày nuôi cấy; ủ tiếp với MTT 0,2mg/ml ở 37oC trong 4 giờ; loại bỏ môi trƣờng, thêm 100 l DMSO lắc đều đọc kết quả ở bƣớc sóng 540 nm trên máy quang phổ Genios TECAN.
− Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inhibition) đƣợc tính tốn dựa trên số liệu đo mật độ quang học OD trên máy quang phổ TECAN theo công thức sau:
− Giá trị IC50 đƣợc tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.Ellipticine là chất tham khảo.
2.4.4 Phân lập các chất từ dịch chiết cây bán hạ roi
Để phân lập hợp chất tinh khiết từ dịch chiết từ cây bán hạ roi, 2 phƣơng pháp sau đƣợc sử dụng:
− Sắc ký cột dùng để phân lập các phân đoạn và hợp chất.
− Máy quang phổ (FT-IR, NMR, DEPT) dùng để phân tích các phân đoạn, từ đó xác định các hợp chất.
Dịch chiết n-hexane
Sắc kí cột silica gel với hệ dung môi rửa giải là n–hexane / ethyl acetate với tỷ lệ theo độ tăng dần của dung môi etylacetate từ 0-100%, và các phân doạn đƣợc phân tích trên máy quang phổ.
Dịch chiết Ethyl acetate
Với chu trình giống cao n-hexane extracts, sắc kí cột silica gel với hệ dung môi rửa giải là chloroform / methanol có tỷlệ theo độ tăng dần của dung môi methanol từ 0-100% đƣợc sử dụng và các phân đoạn đƣợc phân tích trên máy quang phổ. Các dung môi đƣợc loại bỏ.
Dịch chiết Dichloromethane
Cao chiết dichloromethane đƣợc dùng để chạy sắc ký cột với tỷ lệ 2g DCM/ 200g silica gel. Hệ dung môi rửa giải bao gồm: hệ 1: hexane- diclometan (tỷ lệ 9:1, v/v : 1350ml): hệ 2: hexane-diclometan (tỷ lệ 4:1, v/v : 400ml): hệ 3: hexane- diclometan (tỷ lệ 3:2, v/v : 600ml). Các phân đoạn rửa giải đƣợc thu với thể tích là 40ml. Các phân đoạn đƣợc phân tích qua máy quang phổ.
Chúng tôi chọn những tỷ lệ khác nhau (9:1 ; 4:1 ; 3:2) giữa hexane và DCM dựa vào độ phân cực của hệ dung mơi rửa giải. Vì DCM có thể hịa tan hợp chất rất tốt nhƣng lại khiến tốc độ chạy của silica giảm nên hàm lƣợng hexane phải cao hơn DCM. Hệ 1 kém phân cực hơn hệ 2 và hệ 2 kém phân cực hơn hệ 3, vì thế ta có thể so sánh các hợp chất đƣợc phân lập từ 3 hệ để xác định xem hệ nào mang lại kết quả tốt nhất.
2.5 Phƣơng pháp thống kê
Các kết quả thu đƣợc đƣợc xử lý thống kê sinh học thông qua các phần mềm Excel, Microsoft Word.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong Bán hạ roi
Kết quả Bảng 3.1 cho thấy bán hạ roi thu tại Việt Nam không chứa glycoside, saponin, tannin và polysaccharide điều này khác với nghiên cứu trƣớc đây [29,31]. Bán hạ roi trong các mẫu nghiên cứu chứa đƣờng khử, axit amin, axit hữu cơ, chất béo và alkaloid, flavonoid, steroid.
Bảng 3.1Kết quả định tính các nhóm chất trong lồi bán hạ roi
STT Nhóm chất Phản ứng với thuốc thử Kết quả Kết luận
1 Glycoside Phản ứng Liebermann + Khơng có Phản ứng Legal - Phản ứng Baljet - Phản ứng Keller-Kiliani +
2 Saponin Hiện tƣợng tạo bọt - Khơng có
3 Tannin Pb(CH3COO)2 10% + Khơng có FeCl3 5% - Dung dịch Gelatin 1% - 4 Đƣờng khử Thuốc thử Fehling + Có
5 Tinh bột Thuốc thử Lugol - Khơng có
6 Axit amin Thuốc thử Ninhydrin 3% + Có
7 Axit hữu cơ Phản ứng với bột Na2CO3 + Có
8 Flavonoid
Phản ứng Cyanidin +
Có Phản ứng với dung dịch NaOH +
Hơi NH3 + Dung dịch FeCl3 5% + 9 Alkaloid Thuốc thử Mayer + Có Thuốc thử Bouchardat + Thuốc thử Dragendoff -
10 Chất béo Để vết mờ trên giấy lọc + Có
11 Steroid Phản ứng Liebermann + Có
3.2 So sánh các dịch chiết của Bán hạ roi
Sau khi tiến hành các thí nghiệm theo sơ đồ hình 2.2, chúng tơi thu đƣợc 6 dịch chiết: dịch chiết n-hexane, EA, MetOH với EtOH; dịch chiết n-hexane, EA, DCM với MetOH. Chu trình tách chiết bán hạ roi đƣợc chọn có hiệu quả cao do:
− Thứ nhất, tồn bộ các dung mơi đƣợc sử dụng đều phù hợp và phổ biến cho quy trình tách chiết phenol vì chúng có tính trơ. Các dung mơi này có thể hồ tan tốt các hợp chất thí nghiệm, dễ bay hơi và dễ đƣợc loại bỏ [4]. Vì thế ta có thể tiến hành nhiều lƣợt thí nghiệm để đạt kết quả nhƣ mong muốn.
− Thứ hai là các dung môi nhƣ n-hexane, EA, và DCM kém phân cực hơn so với MetOH và EtOH; vì thế chúng sẽ dễ dàng bị hấp thụ bởi MetOH và EtOH, từ đó thu đƣợc các dịch chiết với MetOH và EtOH.
3.2.1 Dịch chiết của Bán hạ roi với EtOH
Sau khi tiến hành cô quay với 3 mẫu: n-hexane, EA và MetOH trong EtOH, ta thu đƣợc 3 dịch chiết (Hình 3.1).
Hình 3.1 Dịch chiết của Bán hạ roi với EtOH của trong dung môi n-hexane (1), EA
(2) và MetOH (3)
Dịch chiết n-hexane có màu nâu vàng, trong khi đó 2 mẫu cịn lại cịn dƣ lại cặn xung quanh lọ. Dịch chiết EA có màu đậm nhất trong khi dịch chiết MetOH có màu sáng hơn dịch chiết n-hexane.
Liên quan đến khối lƣợng của 3 dịch chiết, vì sai số xảy ra trong quá trình cân cặn EtOH (4,29g ± 0,21g ) và thời gian cô quay của 3 mẫu n-hexane + EtOH,
EA + EtOHvàMetOH + EtOH khác nhau nên khối lƣợng của 3 dịch chiết có khác nhau (Bảng 3.2).
Bảng 3.2 Khối lƣợng cặn chiết từng phân đoạn của cây Bán hạ roi với EtOH Dịch chiết Mẫu chiết (g) Dịch chiết Mẫu chiết (g)
n-hexane 2,18
EA 1,73
MetOH 1,35
3.2.2 Dịch chiết của Bán hạ roi với MetOH
Chúng tôi thu đƣợc 3 dịch chiết: n-hexane, EA và DCM (Bảng 3.3)
Bảng 3.3 Khối lƣợng cặn chiết từng phân đoạn của cây Bán hạ roi với MetOH Dịch chiết Mẫu chiết (g) Dịch chiết Mẫu chiết (g)
n-hexane 12,51
EA 7,40
DCM 8,52
Kết quả bảng 3.3 cho thấy dịch chiết n-hexane có khối lƣợng cao nhất. n- hexane không phân cực nên MetOH chỉ phân tán trong n-hexane. Do đó lƣợng MetOH đƣợc bảo toàn. Trái lại, EA và DCM phân cực nhƣng ít phân cực hơn MetOH nên EA và DCM phản ứng với MetOH; do đó hàm lƣợng MetOH giảm.
3.3 Kết quả thử hoạt tính sinh học của Bán hạ roi
Trong trƣờng hợp này, chúng tơi tiến hành phân tích khả năng chống oxi hóa và gây độc của dịch chiết với MetOH là n-hexane, EA, DCM. Các thí nghiệm đƣợc tiến hành tại Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
3.3.1 Kết quả thử hoạt tính DPPH
Bảng 3.4 Giá trị EC50 trong phép phân tích DPPH với dịch chiết của bán hạ roi
STT Dịch chiết EC50 (µg/ml)
1 n-hexane >128
2 DCM >128
3 EA 94,76
Chất chuẩn Quercetin 8,11
Kết quả trên bảng 3.4 cho thấy dịch chiết EA thể hiện hoạt tính chống oxi hóa ở giá trị EC50 = 94,76µg/ml. Hai dịch chiết cịn lại khơng thể hiện hoạt tính này ở giá trị EC50 nhỏ hơn hoặc bằng 128 µg/ml. Trong nghiên cứu của Farida và cộng sự [9,10] dịch chiết bán hạ roi trong EA có khả năng chống oxi hóa.
3.3.2 Kết quả thử độ độc tế bào
Bảng 3.5 Giá trị of IC50 với dịch chiết của Bán hạ roi với các dòng tế bào ung thƣ
Dịch chiết n-hexane DCM EA Ellipticine
KB % kìm hãm các nồng độ thử 128 55,5 60,5 16,5 18,3 27 12,5 9 26 5 2 0 IC50 (µg/ml) 106,82 104,0 >128 0,50 Hep-G2 % kìm hãm các nồng độ thử 128 59,5 64 9 18,3 8 9 0 26 0 0 0 IC50 (µg/ml) 107,76 100,1 >128 0,61 Lu % kìm hãm các nồng độ thử 128 54 58,5 21 18,3 34,5 32 15 26 6 8 0 IC50 (µg/ml) 105,49 92,8 >128 0,47
Hình 3.2 So sánh giá trị IC50 của 2 dịch chiết: n-hexane và DCM với các dòng tế bào ung thƣ
Kết quả trên bảng 3.5 và hình 3.2cho thấy dịch chiết DCM thể hiện hoạt tính gây độc tế bào tại các giá trị IC50 tƣơng ứng:
- IC50 = 104,0µg/ml (với tế bào KB)
- IC50 = 100,1 µg/ml (với tế bào Hep-G2) - IC50 = 92,8µg/ml (với tế bào Lu)
Điều này cho thấy dịch chiết DCM có khả năng kìm hãm tế bào ung thƣ. Trong nghiên cứu Mankaran và cộng sự [19], dịch chiết DCM kìm hãm bệnh máu trắng và trong nghiên cứu của Choon-Sheen Lai và cộng sự [10], dịch chiết DCM kìm hãm sự phát triển của tế bào NCI-H23 với giá trị IC50 = 15,4 µg/ml.
85 90 95 100 105 110 KB Hep-G2 Lu IC 50 (µg/m l) n-hexane DCM
3.3.3 Hoạt tính kháng vi sinh v ật kiểm định của các phân đoa ̣n di ̣ch chiết t ừ bán hạ roi
Bảng 3.6. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các phân đoạn dịch chiết
STT Mẫu
Giá trị IC50 đối với các chủng (µg/ml)
Vi khuẩn Gram Vi khuẩn Gram Nấm men
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)
1 Cặn chiếtn-hecxan >128 >128 >128 >128 >128 >128 >128 2 Cặn chiết DCM >128 >128 >128 >128 >128 >128 >128 3 Cặn chiếtEA >128 >128 >128 >128 >128 >128 >128 Chú thích: (1) Staphylococus areus, (2) Bacillus subtilis, (3) Latobacillus fermentum,(4) Samonella enterica, (5) Escherichia coli, (6) Pseudomonas aeruginosa, (7) Candida albican
Từ kết quả ở bảng 3.6 ta thấy các mẫu dịch chiết khơng có hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật kiểm định trên hệ thử này ở nồng độ <128 µg/m.
3.4 Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất từ Bán hạ roi
Chúng tôi chọn dịch chiết DCM để tiến hành chạy cột sắc ký nhằm mục đích phân lập hợp chất tinh khiết dựa trên các hoạt tính tốt của DCM. Thí nghiệm để xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc thực hiện tại trƣờng Cao đẳng Dƣợc Phú Thọ.
Hệ dung môi triển khai sắc ký là hexane / dichloromethane (tỷ lệ 9:1, v/v – hệ 1) thu đƣợc hai phân đoạn giống nhau, các phân đoạn này đƣợc đem gộp lại và cất loại dung mơi đã thu đƣợc chất TF1. Hệ 1 ít phân cực nhất nên hợp chất dễ dàng đƣợc phân lập.
Từ sơ đồ phân lập dịch chiết (hình 3.3) chúng tơi đã tinh sạch đƣợc hai chất sạch từ bán hạ roi TF1 và TF2 với hàm lƣợng tƣơng ứng là 20 mg và 15 mg.
Hình 3.3. Sơ đồ phân lập hợp chất từ dịch chiết cây bán hạ roi 3.4.1. Chất TF1 3.4.1. Chất TF1
Chất TF1 là chất rắn kết tinh, có nhiệt độ nóng chảy ở 152-155oC.
− Phổ hồng ngoại của chất TF1 cho đỉnh hấp thụ của nhóm carbonyl liên hợp (1678 cm-1).
− Phổ 1H-NMR (Hình 3.4; 3.5 và 3.6) cho thấy có hai nhóm metyl với các tín hiệu singlet tại δH = 0,71 (3H, s, CH3-18) và δH = 1,18 (3H, s, CH3-19), ba nhóm metyl gắn với –CH với các tín hiệu doublet tại: δH = 0,82 (3H, d, J = 6,7 Hz, CH3- 26); 0,84 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-27), 0,86 (3H, d, J = 7,4 Hz, CH3-21) và nhóm metyl gắn với –CH2 với tín hiệu triplet tại : δH = 0,92 (3H, t, J = 6,3 Hz, H-29).
− Sự có mặt của nhóm carbonyl liên hợp cũng đƣợc thấy rõ trong phổ 13C- NMR (Hình 3.6) với các tín hiệu δC =199,598 (s, C-3), 171,653 (s, C-5) và 123,754 (d, C-4) cũng nhƣ tín hiệu δH = 5,72 (1H, br s, H-4). Cặn DCM (8,5g) D2 (1,5g) D3 (1g) D1 (0,5g) D4 (1,2g) D5 (0,8g) CC, Sillica gel n-hexane- DCM TF1(20mg) TF2 (15mg) CC, Sillica gel n-hexane- DCM
− Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của chất TF1 (Hình 3.7)có tín hiệu của 29 nguyên tử carbon, trong đó có 6 nhóm CH3, 11 nhóm CH2, 8 nhóm CH và 4 nguyên tử carbon bậc 4.
Hình 3.5 Phổ 1
H-NMR dãn rộng của chất TF1 (Stigmast-4-en-3-one)
Hình 3.6 Phổ 1H-NMR dãn rộng của chất TF1 (Stigmast-4-en-3-one)
Hình 3.7 Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của chất TF1
Phổ 1H- và 13C-NMR của chất TF1 hoàn toàn phù hợp với phổ của stigmast- 4-en-3-one [14] (Bảng 3.7). Do đó, TF1 là stigmast-4-en-3-one (Hình 3.8) .
Bảng 3.7 Số liệu phổ 1 H- và 13C-NMR của hợp chất TF1 và Stigmast-4-en-3-one STT Chất TF1 Stigmast-4-en-3-one δC δH(J=Hz) δC δH(J=Hz) 1 35,7 34,8 2 34,0 2,26 (1H, ddd, J=2.4, 3.9, 14.5 Hz, H-2A) 32,8 3 199, 6 198,5 4 123, 8 5,72 (1H,br.s, H-4) 122,7 5,72 (1H, s, H-4) 5 171, 7 170,5 6 33,0 31,9 7 32,1 31,0 8 35,7 34,6 9 53,9 52,7 10 38,6 37,5 11 23,1 22,0 12 39,7 38,5 13 42,4 41,3 14 55,9 54,9 15 26,2 25,0 16 28,2 27,1 17 56,1 54,9 18 12,0 0,71 (3H, s, CH3-18) 10,9 0,71(3H, s, H-18) 19 19,1 1,18 (3H, s, CH3-19) 18,0 1,18(3H, s, H-19) 20 36,1 35,0 21 17,4 0,86 (3H, d, J=7,4 Hz, CH3-21) 16,3 0,84 (3H, d, 7,4Hz, H-21) 22 33,9 32,9 23 24,2 23,1 24 45,9 44,7 25 29,2 27,1 26 19,8 0,82 (3H, d, J=6,7 Hz, CH3-26) 18,7 0,82 (3H, d, 6,7Hz, H-26) 27 18,7 0,84 (3H, d, J=7,0 Hz, CH3-27) 17,6 0,84 (3H, d, 7,0Hz, H-27) 28 24,2 23,1 29 12,0 0,92 (3H, t, J=6,3 Hz, CH3 -29) 10,9 0,92(3H, t, J=6,4Hz, H-29)
Hình 3.8Cơng thức cấu tạo của chất TF1
Stigmast-4-en-3-one có thể làm hạ đƣờng huyết để điều trị tiểu đƣờng type II. Trong nghiên cứu của Abildgaard và cộng sự (2003) [5], stigmast-4-en-3-one là