Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp
2.2.9. Phương pháp tinh chế polypeptide bằng HPLC
2.2.9.1. Phương pháp chuẩn bị mẫu cho HPLC
Mẫu polypeptide tái tổ hợp thu được từ bước trên (2.2.8) được ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 10 phút để thu dịch trong. Dịch polypeptide sau đó được lọc khuẩn bởi màng lọc 0.22 µm để loại bỏ các thành phần khơng tan và vi khuẩn trước khi đưa lên cột. Các mẫu polypeptide tái tổ hợp được bổ sung thêm TFA tới nồng độ 0.1 % để proton hóa (axít hóa) đã sẵn sàng để lên cột.
2.2.9.2. Các bước thiết lập chương trình chạy sắc ký
Bật chương trình phần mềm LC-Solution, chọn hệ thống sắc ký, thiết lập các module thành phần bao gồm hệ thống bơm, hệ thống load mẫu, hệ thống phát hiện mẫu, hệ thống thu mẫu,…
Thiết lập thời gian chạy mẫu, tốc độ dịng, thể tích load mẫu. Đặt chương trình cho tốc độ trộn của kênh B.
Thiết lập chương trình và chế độ thu mẫu, thể tích cho mỗi phân đoạn. Thiết lập bước sóng phát hiện protein chảy qua hệ thống phát hiện mẫu.
Hình 5: Giao diện phần mềm LC solution
2.2.9.3. Qui trình tinh chế
- Thời gian chạy: 20 phút - Tốc độ chạy: 1 ml/phút.
- Lượng mẫu load lên cột: 100 – 200 l - Chế độ chạy: Low pressure gradient - Detector (hoặc PDA): D2
- Đặt chế độ thu mẫu: từ phút thứ 12-14 (tùy thuộc). Mỗi phân đoạn có thể tích là 0.5 ml.
- Chương trình chạy được mơ tả như sau: (theo trình tự thời gian thực)
0’00 : 20 % B 0’01 – 6’00 : 50% B 6’01 : 100% B 6’01 – 19’00 : 100% B 19’01 : 20% B 19’01 – 22’00 : 20% B Kết thúc
Lưu ý thu mẫu trong khoảng từ phút thứ 12 đến phút 14, thu theo phân đoạn, mỗi phân đoạn 0.5 ml.
Nhập các thông số lên hệ thống.
Tiến hành chạy từng lần đơn lẻ (Single run) hoặc chạy liên tiếp nhiều lần (Batch).
Quan sát và theo dõi kết quả thu được, nếu phát hiện bị lỗi do thao tác hoặc một sự cố ngẫu nhiên thì tạm dừng chương trình để xử lý.