Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Kết quả kiểm tra hoạt tính sinh học của các đoạn polypeptide tái tổ hợp
3.3.1. Kết quả thử độc cấp tính của α-cobratoxin và polypeptide
Độc tính cấp của α-cobratoxin và peptide được tiến hành như đã mô tả trong phần phương pháp nghiên cứu. Sau khi tiêm các chất, chuột được theo dõi liên tục trong vòng 24 giờ đối với các biểu hiện chức năng của chuột. Số lượng chuột chết ở từng lô cũng được theo dõi và ghi nhận trong vịng 72 giờ. Kết quả thu được về tính độc cấp của α-cobratoxin và peptide được trình bày ở bảng 4 và bảng 5.
Kết quả bảng 4 cho thấy, sau khi đã tiêm α-cobratoxin cho chuột và theo dõi trong 72 giờ thì mức liều cao nhất chưa gây chết một con chuột nào là 0,4 mg/kgP và mức liều thấp nhất gây chết 100% động vật thí nghiệm là 0,8 mg/kgP.
1 2 3 4 5 6 Polipeptide ~ 4 kDa kDa 16.95 6.2 3.5 2.5 14.4
Áp dụng công thức đã nêu ở phần phương pháp với liều độ ở mức độ cao nhất X5= 0,8 mg/kgP và cũng là mức liều thấp nhất gây chết 100% động vật thí nghiệm được sử dụng để tính tốn, khoảng cách giữa các mức liều d = 0.1. Số động vật sử dụng trong từng lơ thí nghiệm n = 6 (con). Số lơ động vật được sử dụng trong nghiên cứu này là 5 lô. Số động vật chết đếm được ở các lơ (khơng tính lơ chết 100% động vật) trong vịng 72 giờ là: mi = 8 con.
Bảng 4. Độc tính cấp của α-cobratoxin trên chuột thí nghiệm
Lơ Liều nọc rắn (mg/kgP)
Tỷ lệ chuột chết
sau 72 giờ Biểu hiện chức năng trong vòng 24 giờ 1 0,4 0/6 Chuột xù lông, thu nhận thức ăn, nước uống giảm 2 0,5 1/6 Chuột di chuyển chậm chạp, tim đập nhanh 3 0,6 3/6 Di chuyển chậm, tim đập nhanh,chết sau 4 -2 4 giờ 4 0,7 4/6 Di chuyển chậm,tim đập nhanh, chết sau 4-10 giờ 5 0,8 6/6 Di chuyển chậm ngay sau khi tiêm, chết sau 3 - 8 giờ 6 ĐC 0/6 Chuột khoẻ mạnh, di chuyển và ăn uống bình thường
Từ đó, chúng tơi tính được LD50 hay liều gây chết 50% động vật thí nghiệm của α-cobratoxin như sau:
Giá trị SE của LD50:
Như vậy, α-cobratoxin gây độc cho động vật nghiên cứu và liều gây độc cấp hay gây chết 50% động vật thí nghiệm của α-cobratoxin là 0,617 ± 0,035 mg/kgP.
Kết trong bảng 5 cho thấy, việc tiêm peptide cho chuột (từ liều 3 mg/kgP đến liều 50 mg/kgP) vẫn không làm chuột bị chết mặc dù ở các liều cao ≥ 15 mg/kgP chuột có biểu hiện lờ đờ và di chuyển chậm chạp hơn so với các lơ thí nghiệm khác. Ở các nồng độ thấp hơn, chuột hoàn toàn khoẻ mạnh bình thường. Như vậy, có thể kết luận rằng polypeptide rất ít độc và khơng xác định được liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50).
Bảng 5. Độc tính cấp của peptide trên chuột thí nghiệm
Lô Tiêm peptide (mg/kgP/lần)
Tỷ lệ chuột
chết sau 72 giờ Biểu hiện chức năng trong vòng 24 giờ 1 3 0/6 Chuột khoẻ mạnh, di chuyển và ăn uống bình thường 2 6 0/6 Chuột khoẻ mạnh, di chuyển và ăn uống bình thường 3 9 0/6 Chuột khoẻ mạnh, di chuyển và ăn uống bình thường 4 12 0/6 Chuột khoẻ mạnh, di chuyển và ăn uống bình thường. 5 15 0/6 Chuột di chuyển chậm chạp sau khi tiêm thuốc nhưng sau đó chuột trở lại khoẻ mạnh, di chuyển bình thường 6 25 0/6 Chuột di chuyển chậm chạp sau khi tiêm thuốc nhưng
sau đó chuột trở lại khoẻ mạnh ăn uống bình thường 7 50 0/6 Chuột di chuyển chậm chạp sau khi tiêm thuốc, sau đó
chuột trở lại khoẻ mạnh, biểu hiện bình thường. 8 ĐC 0/6 Chuột khoẻ mạnh, di chuyển và ăn uống bình thường
3.3.2. Tác dụng của peptide khi tiêm vào chuột đã bị tiêm nọc độc rắn.
Qua bảng 4 chúng tơi nhận thấy liều gây chết 100% chuột thí nghiệm của α- cobratoxin là 0,8 mg/kgP vì vậy chúng tôi sử dụng liều này để gây độc cho các lơ chuột thí nghiệm theo đường tiêm bắp. Sau khi tiêm nọc rắn, tiếp tục tiêm peptide cho chuột với thời gian và nồng độ như trên bảng 6.
Bảng 6: Tác động của peptide lên tỷ lệ chết của chuột đã bị tiêm nọc rắn.
Lô Liều nọc rắn
Liều peptide (mg/kgP/lần)
Thời điểm tiêm Peptide
Tỉ lệ chuột chết sau 72 giờ
Biểu hiện chức năng trong vòng 24 giờ 1 0,8 mg/ kgP 0 Không tiêm peptide 6/6 Chuột chết trong 2h 2 25 30 phút sau khi tiêm nọc rắn 6/6 Chuột chết trong 3h 3 50 30 phút sau khi tiêm nọc rắn 6/6 Chuột chết trong 4h
Nhìn vào bảng kết quả 6 cho thấy, khi tiêm peptide vào chuột đã bị tiêm nọc độc thì peptide khơng có khả năng làm thay đổi tỷ lệ chuột chết. Có thể thấy một số vấn đề có thể là nguyên nhân đưa đến kết quả này. Thứ nhất, trong khi peptide chỉ có khả năng tương tác với độc tố thần kinh α – Cbtx trong nọc rắn hổ mang N. kaouthia – đây là thành phần độc nhất trong nọc rắn nhưng không phải là phần chiếm khối lượng lớn nhất, trong nọc rắn chứa hàng nghìn protein khác nhau, chúng ta lại khơng có α – Cbtx tinh sạch mà thay vào đó sử dụng tồn bộ nọc rắn. Thứ hai, có thể do α – Cbtx có ái lực gắn với thụ thể khác nhau ở các lồi khác nhau. Vì vậy một thí nghiệm tiếp theo được bố trí trong đó nọc độc được tương tác trực tiếp với chuỗi polypeptide bằng cách trộn chúng thành một hỗn dịch rồi ủ 30 phút sau đó tiêm cho chuột thí nghiệm.
3.3.3. Tác động của hỗn dịch polypeptide và α-cobratoxin trên chuột
Do những nguyên nhân đã trình bày ở trên kết hợp với những hạn chế về thời gian và kinh phí dẫn đến việc khơng thể có α – Cbtx tinh sạch để trực tiếp phân tích tương tác giữa α – Cbtx và peptide đã thiết kế nên chúng tôi quyết định tiến hành thêm một thí nghiệm kiểm tra khả năng của peptide trong việc hạn chế tác dụng gây độc của nọc rắn toàn phần bằng cách trộn peptide với nọc rắn với liều lượng và thời gian ủ xác định sau đó tiêm cho chuột thí nghiệm. Kết quả được trình bày trên bảng 7.
Bảng 7. Tác động của hỗn dịch peptide và α-cobratoxin trên chuột thí nghiệm.
Lơ Liều nọc rắn
Liều peptide
(mg/kgP/lần) Thời điểm tiêm
Tỉ lệ chuột chết sau 72 giờ
Biểu hiện chức năng trong vòng 24 giờ 1 0,8 mg/kgP 0 Trộn α-cobratoxin với nước cất để 30 phút trước khi tiêm
6/6 Chuột chết trong vòng 2 giờ
2 25
Trộn peptide và α-cobratoxin ủ 30 phút trước khi tiêm
6/6 Chuột chết trong vòng 3 giờ
3 50
Trộn peptide và α-cobratoxin ủ 30 phút trước khi tiêm
6/6 Chuột chết trong vòng 4 giờ
Từ những kết quả thu được ở trên, ta có thể đi đến kết luận peptide đã được thiết kế khơng có khả năng kháng nọc độc tổng số của rắn hổ mang đất N. kaouthia. Vì mục tiêu thiết kế polypeptide này là để thu được chuỗi polypeptide mơ hình có khả năng gắn ái lực cao với độc tố nọc rắn α – Cbtx nên cần có một phân tích trực tiếp để kiểm tra tương tác của peptide thiết kế với độc tố thần kinh α – Cbtx. Đó là bước đầu tiên duy nhất để đánh giá chất lượng của chuỗi polypeptide đã được mô phỏng.
Mặc dù vậy, việc nghiên cứu ứng dụng và làm chủ phần mềm Discovery studio giúp phát triển những hướng nghiên cứu mới trong khoa học cơ bản cũng như trong chiến lược phát triển các loại dược phẩm mới. Phần mềm này thực sự là một công cụ hỗ trợ hữu ích cho các nhà khoa học trong nghiên cứu.