Vật liệu nghiên cứu

CHƢƠNG 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.2. Vật liệu nghiên cứu

Các thí nghiệm sử dụng các hóa chất, dụng cụ và thiết bị chuyên môn, đạt các tiêu chuẩn cơ bản dùng trong nghiên cứu vi sinh vật học.

2.2.1. Nguồn và chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu

2.2.1.1. Nguồn vi sinh vật để phân lập các chủng có khả năng ức chế quorum sensing

Để phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng ức chế quá trình quorum sensing, chúng tôi sử dụng nguồn mẫu đất, bùn thu thập tại:

- Vườn Quốc Gia Xuân Thuỷ, huyện Giao Thuỷ, tỉnh Nam Định.

- Vườn Quốc Gia Cúc Phương, thuộc địa giới hành chính của ba tỉnh Ninh Bình, Thanh Hoá và Hoà Bình

- Huyện Thái Thuỵ, tỉnh Thái Bình - Huyện Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc

Mẫu đất được lấy theo quy trình chuẩn của Hiệp hội Bảo vệ Mơi trường Mỹ (EPA standard operating procedures, 2012), ở độ sâu 20 cm, bằng cách sử dụng dụng cụ lấy mẫu (sampling scoop) đã qua khử trùng bằng cồn 70%. Bùn được lấy theo quy trình chuẩn của EPA(1999) bằng cách sử dụng gầu lấy mẫu Ponar.

2.2.1.2. Chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu

Chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu này là Vibrio harveyi NBRC

15634 được cung cấp bởi bảo tàng giống vi sinh vật NBRC, Nhật Bản.

2.2.2. Hóa chất và thiết bị

2.2.2.1. Các loại hóa chất sử dụng trong thí nghiệm

+ Hóa chất pha mơi trường

- Pepton, NaCl xuất xứ Trung Quốc (Xilong) - Cao nấm men (Sigma, Hoa Kỳ)

- Thạch agar (Việt Nam) - TCBS agar (Merck, Đức)

+ Hoá chất dùng trong các phản ứng sinh hoá

- Hoá chất nhuộm Gram: tím kết tinh, Lugol, cồn tẩy, Safranin

- Hoá chất dùng trong phản ứng lên men yếm khí: Bromthymol blue (1%), Glucose 10%

- Hoá chất dùng trong phản ứng MR-VP: α-napthol 5%, KOH 40%, methyl red.

- Hoá chất dùng trong phản ứng ONPG: ONPG (O-Nitrophenyl-β-D- galactopyranoside), lactose, phenol red.

Các hoá chất trên có xuất xứ Trung Quốc, trừ ONPG (cung cấp bởi Merck).

+ Hóa chất dùng trong các phản ứng PCR, điện di

- Nước tinh khiết khơng có nuclease

- DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) do hãng Thermo Scientific cung cấp.

- HydraGreen Safe DNA Stain 20000x, , Loading Dye 6x, Gene Ruler 1kb DNA ladder được cung cấp bởi Affymetric USB, Merck và Fermentas (Mỹ).

+ Hóa chất tinh sạch DNA

- Cột tinh sạch spin column

- Dung dịch NTI (Binding Buffer) - Dung dịch NT3 (Washing Buffer) - Dung dịch Elution Buffer

- Cột DNA-spin

Tất cả do Macherey-nagel, Đức cung cấp

2.2.2.2 Dụng cụ, thiết bị, máy móc

- Đĩa petri, que cấy, đèn cồn - Pipet và đầu côn các loại

- Máy đo OD Thermo scientific Biomate 3, Mỹ - Máy ly tâm 5417R (Eppendorf, Đức)

- Bể ổn nhiệt Julabo, Đức

- Tủ lắc ổn nhiệt WiseCube, Hàn Quốc - Máy voltex

- Máy PCR 9700 (Applied Biosystems, Mỹ) - Bàn soi gel LMW-20 UPV(UK).

- Máy điện di ngang (BioRad, Mỹ) - Kính hiển vi quang học (Zeiss, Đức)

- Box cấy vô trùng (Daihan Labtech, Ấn Độ) - Tủ ấm 37C

- Nồi hấp khử trùng ES - 315 (Tomy, Nhật Bản)

- Máy đo phát quang TD-20/20 Luminometer (Promega, Mỹ)

2.2.3. Thành phần môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu: 2.2.3.1. Môi trƣờng LB 0,5 % NaCl

Môi trường này dùng để phân lập VSV và ni cấy chủng VK có khả năng ức chế quá trình phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của V. harveyi.

Bảng 2.1 Thành phần môi trƣờng LB 0,5% NaCl nuôi cấy các VSV phân lập

Pepton 10g

Cao nấm men 5g

NaCl 10g

Agar (Nếu là MT thạch) 16g

Nước cất 1000ml

pH = 7,5, khử trùng ở 121C trong 20 phút

2.2.3.2. Môi trƣờng TCBS Agar

Bảng 2.2.Thành phần môi trƣờng TCBS để chọn lọc vi khuẩn Vibrio

Proteose peptone 10 g Yeast extract 5 g Sodium citrate 10g Sodium thiosulfate 10g Ox bile 8g Sucrose 20g Sodium chloride 10g Ferric citrate 1 g Thymol blue 0.04g

Brom thymol blue 0.04

Agar 14g

H2O 1000ml

2.2.3.3. Môi trƣờng LB với nồng độ 1%; 3% và 5% NaCl

Môi trường với thành phần như bảng 2.1 nhưng với nồng độ NaCl là 3% được sử dụng để nuôi cấy và phân lập Vibrio harveyi và các chủng đối kháng khác.

Ngoài ra, môi trường LB 3% NaCl với điều kiện pH = 6,5, pH = 8, pH = 9 cũng được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH khả năng ức chế sự phát sáng ở

Vibrio harveyi của các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân lập được.

Các môi trường LB với nồng độ NaCl là 1% và 5%, cùng với môi trường LB với nồng độ NaCl 3%, pH 8 được dùng để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng ức chế sự phát quang sinh học ở Vibrio harveyi của các chủng đối

kháng khác.