Phân tích gen 16S rRNA của vi khuẩn

CHƢƠNG 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.4. Phân tích gen 16S rRNA của vi khuẩn

Sau khi phân lập và tuyển chọn được chủng VSV có triển vọng đối kháng cao, tiến hành tách DNA tổng số, gen 16S rRNA được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi p63F (5′CAGGCCTAACACATGCAAGTC3′,mồi xuôi) và p1378R (5’CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG3’,mồi ngược) [24] được cung cấp bởi Integrated ADN Technologies - IDT (Singapore). Độ đặc hiệu và hiệu quả của cặp mồi này đã được nghiên cứu và thử nghiệm với nhiều loài vi khuẩn và mẫu môi trường, cho thấy cặp mồi này rất hữu ích cho khuếch đại gen 16S rADN trong nghiên cứu về sinh thái vi sinh vật.

2.3.4.1. Phƣơng pháp tách DNA tổng số

+ Ni cấy vi khuẩn: Các chủng vi khuẩn có hoạt tính ức chế phát quang liên quan tới quorum sensing của các vi khuẩn Vibrio được nuôi cấy trên môi trường LB 3% NaCl.

- Hút 1 ml nước MQ đã khử trùng vào ống eppendorf.

- Dùng tăm bông vô trùng (hoặc que cấy) lấy khuẩn lạc đã ni cấy trên đĩa mơi trường, hịa tan tế bào vào ống eppendoft đã chuẩn bị, trộn đều bằng vortex rồi đem ly tâm ở 8000 vòng/ph trong 10 phút (rửa mẫu).

- Hút bỏ phần dịch  cho 300µl nước MQ vơ trùng vào mẫu, trộn đều cho phần cặn hịa tan lại.

- Bở sung 300 µl hỗn hợp Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) mix kỹ bằng vortex hoặc dùng tay trong khoảng 30 giây.

- Ly tâm ở 14000v/p, nhiệt độ phòng, trong 12 - 15 phút.

- Dùng pipet nhẹ nhàng hút pha dịch nổi trên cùng và chuyển sang 1 ống eppendorf khác (200 µl).

- Bở sung theo thứ tự: 1 µl Glycogen; 100µl ammonium acetate 7,5M; và 750 µl Ethanol 100%.

- Ủ trong ngăn đá (- 20oC) qua đêm

- Ly tâm ở 14000v/p, 4C trong 30 - 40 phút để tủa DNA.

- Gạn bỏ phần dịch, bổ sung 150 µl ethanol 70%, mix nhẹ bằng pipet.

- Ly tâm ở 14000v/p, 4oC trong 10 phút để rửa DNA. Lặp lại bước này 2 lần. - Nhẹ nhàng gạn bỏ phần dịch, để khô.

- Bở sung 20 – 100 µl nước PCR vào để hịa tan DNA (tùy vào mỗi mẫu). - Dịch DNA được giữ ở -200C

- Điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA

2.3.4.2. Phƣơng pháp PCR

Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR 9700, với điều kiện phản ứng: khởi đầu biến tính ở 95oC trong 5 phút; tiếp theo là 30 chu trình PCR (biến tính ở 94oC trong 45 giây, gắn mồi ở 50oC trong 45 giây và tổng hợp sợi ở 72o

C trong 1 phút). Phản ứng được kết thúc với 5 phút ở 72oC.

- Thành phần phản ứng PCR: Water nuclease free 8,5µl

Master Mix 2X 12,5µl

Primer p1378R 1,5µl

DNA template: 1µl. Đối chứng âm (-) thêm 1µl water nuclease free. Tởng thể tích: 25µl/ống. - Chu trình nhiệt: 95C 5 phút 94C 45s 53C 45s 30 cycles 72C 60s 72C 5 phút

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1 %. Gel được chạy trên thiết bị điện di với đệm TAE ở điện thế 100V trong 20 phút. Bản gel được kiểm tra bằng máy soi gel.

2.3.4.3. Phƣơng pháp điện di, soi gel

Sản phẩm PCR cần kiểm tra được nhuộm và điện di trên gel agarose 1%, đệm TAE 1X, điện trường với hiệu điện thế 100V/20 phút.

Tiếp đó, tiến hành soi gel chụp ảnh sản phẩm điện di bằng máy soi UV.

2.3.4.4. Phƣơng pháp tinh sạch DNA

Kit NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (Macherey-nagel, Đức) được sử dụng để tinh sạch DNA. Các bước bao gồm:

- Chuẩn bị các cột tinh sạch

- Cho dung dịch NTI vào từng ống mẫu sản phẩm PCR (tỉ lệ 2:1) - Hỗn hợp được trộn đều và cho vào từng cột bằng pipet.

- Cho các cột vào ly tâm 12000rpm, 30s, 20C

- Đổ bỏ dịch thừa, cho dung dịch NT3 vào các cột. Ly tâm 12000rpm, 30s, 20C.

- Đổ bỏ dịch rửa. Rửa lại tiếp với NT3, ly tâm điều kiện trên. - Đổ bỏ dịch rửa. Ly tâm 12000rpm, 1 phút, 20C.

- Chuẩn bị các ống eppendorf sạch. Cho các cột tinh sạch vào các ống epps đã ghi tên tương ứng.

- Cho thêm 15µl dung dịch Elution Buffer vào từng cột. - Ly tâm 12000rpm, 1 phút, 20C.

- Loại cột; thu DNA đã tinh sạch trong các ống eppendorf. - Giữ ở -20C.

2.3.4.5. Phƣơng pháp phân tích trình tự

Gen 16S rARN của vi khuẩn XTS1 (~1300 bp) được khuếch đại bằng phản ứng PCR. Việc giải trình tự được thực hiện bởi First Base (Singapore). Các trình tự gen sau đó được phân tích bằng phần mềm Chromas version 2.4, đối chiếu với trình tự 16S rADN của các loài có liên quan hiện đã cơng bố trên cơ sở dữ liệu trình tự của GenBank bằng công cụ BLAST Search.

2.3.5. Chỉ tiêu theo dõi chung

Hiệu quả đối kháng (thí nghiệm trong phịng) tính theo công thức Abbott

HQ(%) = (1 - CT ) x 100 ĐC

Trong đó:

HQ(%): hiệu quả đối kháng CT : cơng thức thí nghiệm ĐC : đối chứng

2.3.6. Phƣơng pháp tính tốn thống kê xử lý số liệu

Số liệu thí nghiệm được xử lý bằng các thuật toán thống kê cơ bản, thông qua phần mềm Microsoft Excel và IRRISTAT 4.0.

Chƣơng 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Xác định mối tƣơng quan giữa mật độ tế bào và cƣờng độ phát quang đo đƣợc của Vibrio harveyi tại cùng một thời điểm đƣợc của Vibrio harveyi tại cùng một thời điểm

Để xác định mối liên hệ giữa mật độ tế bào với quá trình phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing, chúng tôi tiến hành lấy dịch nuôi cấy Vibrio harveyi và đem đo OD600nm và đo cường độ phát quang trên máy TD-20/20 Luminometer ở các thời điểm 0h, 6h, 12h và 18h. Ở thời điểm 0h (mới bắt đầu nuôi lắc), mật độ tế bào và lượng phát quang là xấp xỉ bằng 0. Sau đó, mật độ tế bào và cường độ phát quang bắt đầu tăng dần. Lượng phát quang đạt cực đại ở thời điểm 12h và mật độ tế bào đạt cực đại ở thời điểm 18h (OD600nm ~ 1,8). Vào thời điểm 12h, khi lượng phát quang đạt cực đại, ta có thể quan sát sự phát quang sinh học của vi khuẩn V. harveyi bằng mắt thường. Sau thời điểm này, lượng phát quang giảm dần, và đến khoảng 18h sau thời điểm nuôi cấy, không thể quan sát sự phát quang sinh học của V. harveyi bằng mắt thường.

Hình 3.1. Đồ thị mơ tả sự tƣơng quan giữa giá trị OD600nm và lƣợng phát quang của Vibrio harveyi tại các thời điểm 0h, 6h, 12h và 18h.

Tóm lại, khi mật độ tế bào thấp, lượng phát quang đo được rất thấp, các tế bào liên lạc với nhau ít và có lẽ khơng đủ để tạo sự phát quang nhận biết bằng mắt thường. Khi mật độ tế bào tăng dần và đạt cực đại, các phân tử tín hiệu sinh ra bởi

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 0h 6h 12h 18h OD600nm Cường độ phát quang Cƣờn g độ phát quan g OD60 0nm Thời gian

các tế bào thơng qua quá trình quorum sensing, hoạt hoá sự phiên mã của các gen sản xuất các enzyme luciferase dẫn đến phát quang sinh học. Lúc này, lượng phát quang đo được rất cao và quan sát bằng mắt thường trong bóng tối có thể nhận biết được hiện tượng phát sáng này ở Vibrio harveyi.

3.2. Phân lập và tuyển chọn một số vi sinh vật có khả năng ức chế quá trình phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi 3.2.1. Phân lập các vi sinh vật ở các vùng ao nuôi tôm, rừng ngập mặn, đất, bùn của tỉnh Nam Định và Ninh Bình.

Để thu thập được nguồn vi sinh vật có hoạt tính ức chế quá trình phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn Vibiro harveyi gây bệnh trên

động vật thuỷ sản, từ 30 mẫu đất và bùn ở các vùng rừng ngập mặn, đất bìa rừng, đầm, bùn đáy ao nuôi tôm,… thu thập được ở các tỉnh Nam Định và Ninh Bình, chúng tơi tiến hành phân lập vi sinh vật, sau đó tinh sạch và các chủng này sẽ được đem thử hoạt tính ức chế phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi trong điều kiện invitro nhằm tìm ra những chủng vi sinh vật

có hoạt tính ức chế tốt.

Bảng 3.1. Số chủng vi sinh vật phân lập đƣợc từ 2 tỉnh Nam Định và Ninh Bình

TT Địa điểm thu mẫu Số mẫu thu thập Số chủng VSV phân lập đƣợc

1 Nam Định 20 140

2 Ninh Bình 10 159

Tổng số 30 299

Trong tổng số 30 mẫu thu thập tại 2 tỉnh Nam Định và Ninh Bình, có 299 chủng thu được (đều là vi khuẩn) trên môi trường LB 3% NaCl, khoảng 34 chủng mọc trên môi trường TCBS.

3.2.2 Xác định khả năng ức chế sự phát sáng liên quan đến quorum sensing ở

Vibrio harveyi của các vi sinh vật phân lập

3.2.2.1. Khả năng ức chế sự phát sáng ở Vibrio harveyi của các vi sinh vật phân lập đƣợc

Để xác định hoạt tính ức chế sự phát sáng liên quan đến quorum sensing ở

Vibrio harveyi của các vi khuẩn đã phân lập được, chúng tôi tiến hành thử hoạt tính

theo phương pháp ở mục 2.3.1.2.

Các chủng thu được đem thử hoạt tính trên đĩa 96 giếng và mức độ phát sáng của V. harveyi được quan sát bằng mắt thường ở thời điểm 6h, 12h và 18h. Ở thời điểm 12h sau khi tiến hành thí nghiệm, chúng tơi thu được 2 chủng (trong đó có 1 chủng phân lập từ mẫu đất Cúc Phương, Ninh Bình và 1 chủng phân lập từ mẫu đất Xuân Thuỷ, Nam Định) có khả năng ức chế sự phát sáng của Vibrio harveyi. Các

giếng đối chứng chỉ chứa môi trường và các giếng chứa môi trường chứa VSV được thử hoạt tính đều khơng sáng, cịn giếng đối chứng chỉ có Vibrio harveyi sáng rất mạnh. Còn ở các thời điểm 6h và 18h sau khi tiến hành thí nghiệm trên, quan sát bằng mắt thường trong bóng tối thì các giếng thí nghiệm đều khơng sáng. Kết quả ở mục 3.1 cho thấy, ở các thời điểm 6h và 18h, sự phát quang của V. harveyi không

đạt mức độ cực đại. Như vậy, thời điểm lý tưởng để quan sát bằng mắt thường sự phát quang của Vibrio harveyi là khoảng 12h sau khi tiến hành thí nghiệm trên.

Bảng 3.2. Kết quả phân lập đƣợc một số chủng vi khuẩn nghi ngờ có hoạt tính ức chế sự phát quang sinh học ở Vibrio harveyi

Kí hiệu chủng

Giếng chứa dịch ni (Độ sáng sau 12h)

Giếng 1 Giếng 2 Giếng 3 Giếng 4

CP1 + Vh + + + +

XTS1 + Vh - - - -

Chỉ có Vh +++ +++ +++ +++

Ghi chú: Các kí hiệu gồm có:

XTS1 + Vh: Giếng chứa mơi trường + XTS1 + Vibrio harveyi

Sáng mạnh: (+++) Sáng yếu: (+) Không sáng: (-) Các giếng 1,2,3,4 là các giếng lặp lại cùng 1 thí nghiệm.

Hình 3.2. Kết quả thử hoạt tính ức chế phát quang sinh học ở Vibrio harveyi của các chủng XTS1, CP1, CP10. Các giếng đối chứng không phát sáng: giếng chỉ

có XTS1 (XTS1), giếng chỉ có CP1 (CP1); CP10 (CP10), giếng chỉ có mơi trường (MT). Giếng đối chứng phát sáng: chỉ có Vibrio harveyi (Vh). Giếng CP1 + Vh, CP10 + Vh, XTS1 + Vh lần lượt là hỗn hợp dịch nuôi loại tế bào của CP1, CP10,

XTS1 và dịch tế bào V. harveyi. Giếng 1, 2, 3, 4 lặp lại cùng 1 thí nghiệm. Như vậy, sau khi thử hoạt tính của các chủng vi khuẩn phân lập được trên đĩa 96 giếng, cũng thu được 2 chủng nghi ngờ có hoạt tính ức chế sự phát quang sinh học của Vibrio harveyi (các giếng sáng yếu, không sáng so với đối chứng Vibrio harveyi sáng mạnh); đó là các chủng XTS1 và CP1 (Bảng 3.2, Hình 3.2)

3.2.2.2. Kiểm tra khả năng ức chế sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn đối kháng

Để kiểm tra bản chất hoạt tính ức chế của 2 chủng này là ức chế sinh trưởng hay thực sự là ức chế sự phát sáng của Vibrio harveyi (liên quan đến quorum

sensing), chúng tơi tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu đồ thị sinh trưởng và sau đó dùng phương pháp cấy vạch vng góc để thử hoạt tính ức chế sinh trưởng (tạo

1 2 3 4

vịng vơ khuẩn) của dịch ni 2 chủng vi khuẩn XTS1 và CP1 với Vibrio harveyi.

+ Nghiên cứu đồ thị sinh trưởng của vi khuẩn Vibrio harveyi, XTS1 và CP1

Tiến hành đo mật độ tế bào (OD600nm) ở các thời điểm 1h, 2h, 5h, 6h sau khi nuôi cấy từ dịch tế bào đã nuôi lắc qua đêm của các chủng VSV này trong môi trường LB 3% NaCl mới. Kết quả thể hiện ở hình 3.3.

Hình 3.3. Đồ thị sinh trƣởng của các chủng VSV.

Dựa vào đồ thị sinh trưởng của các chủng VSV cần đo, ta thấy tốc độ sinh trưởng của chủng XTS1 là nhanh nhất, sau đó đến Vibrio harveyi, CP1 và CP10,

một chủng đối chứng khơng có hoạt tính đối kháng (sai số ± 0.05). Tuy nhiên, sự chênh lệch về tốc độ sinh trưởng giữa các chủng VSV trên không quá nhiều.

+ Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế sinh trưởng của các chủng CP1 và XTS1 với Vibrio harveyi bằng phương pháp cấy vạch vng góc

Tiến hành thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế sinh trưởng của 3 chủng CP10, CP1 và XTS1 với V. harveyi (trong đó 2 chủng CP1 và XTS1 là 2 chủng

triển vọng có hoạt tính ức chế sự phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của Vibrio harveyi, còn chủng CP10 là chủng khơng có hoạt tính ức chế sự phát

quang sinh học) bằng phương pháp cấy vạch vng góc. Kết quả thể hiện trong hình 3.4. 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 1h 2h 4h 5h 6h Vibrio harveyi XTS1 CP1 CP10 OD60 0nm Thời gian

Hình 3.4. Kết quả khảo sát tính đối kháng giữa các chủng Vibrio harveyi và 3 chủng VSV phân lập đƣợc (CP10, CP1 và XTS1) bằng phƣơng pháp cấy vạch vng góc. Trong đó, Vh là kí hiệu của vi khuẩn Vibrio harveyi.

Đường cấy của Vibrio harveyi (Vh) với lần lượt các chủng CP10 (đối chứng khơng có hoạt tính), XTS1, CP1 mọc sát nhau chứng tỏ giữa Vibrio harveyi và 3

chủng này có khả năng tương thích với nhau (hình 3.4). Do đó, các chủng XTS1, CP1 không ức chế sinh trưởng của Vibrio harveyi. Như vậy, hai chủng vi khuẩn

XTS1 và CP1 có hoạt tính ức chế sự phát sáng liên quan đến quorum sensing của

Vibrio harveyi mà không ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn này.

+ Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế sinh trưởng của các chủng CP1 và XTS1 với Vibrio harveyi bằng phương pháp đục lỗ thạch

Trong hình 3.5, sau khi cấy trải V. harveyi trên bề mặt thạch, dịch mơi trường khơng có vi khuẩn (MT), dịch nuôi của XTS1 và CP1 được nhỏ vào lỗ thạch đã đục. Kết quả cho thấy khơng có vịng vơ khuẩn của V. harveyi gây ra bởi đối

chứng (môi trường), dịch nuôi của XTS1. Như vậy, dịch nuôi của các chủng vi khuẩn XTS1, CP1 không ức chế sự sinh trưởng của V. harveyi, hay nói một cách

Hình 3.5. Kết quả khảo sát sự ức chế sinh trƣởng giữa các chủng XTS1 và CP1 với V.harveyi bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch. Trong đó, MT là đối chứng mơi trƣờng LB 3% lỏng khơng có vi khuẩn.

Từ các kết quả kiểm tra khả năng ức chế sinh trưởng của các chủng VSV đối kháng, có thể kết luận rằng các chủng vi khuẩn XTS1, CP1 có khả năng ức chế phát quang sinh học mà không ức chế sự sinh trưởng của Vibrio harveyi.

3.3. Kết quả phân tích định lƣợng khả năng ức chế sự phát sáng liên quan đến quorum sensing ở Vibrio harveyi của các VSV phân lập đƣợc quorum sensing ở Vibrio harveyi của các VSV phân lập đƣợc

Để xác định rõ kết quả thu được, tiến hành đo cường độ phát quang từ các giếng thí nghiệm bằng máy TD-20/20 Luminometer. Kết quả đo được biểu thị trong hình 3.6.

Từ đồ thị biểu thị cường độ phát quang đo ở các giếng thí nghiệm trong hình 3.6, có thể nhận thấy sau khi bổ sung dịch nuôi loại tế bào của chủng vi khuẩn XTS1 vào các giếng môi trường chứa Vibrio harveyi thì cường độ phát quang đo được là thấp nhất. Cường độ phát quang của Vibrio harveyi ở giếng bổ sung dịch

nuôi của chủng vi khuẩn CP1 cũng giảm khá thấp. Cịn giếng bở sung dịch ni của