KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định mối tƣơng quan giữa mật độ tế bào và cƣờng độ phát quang đo đƣợc của Vibrio harveyi tại cùng một thời điểm đƣợc của Vibrio harveyi tại cùng một thời điểm
Để xác định mối liên hệ giữa mật độ tế bào với quá trình phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing, chúng tôi tiến hành lấy dịch nuôi cấy Vibrio harveyi và đem đo OD600nm và đo cường độ phát quang trên máy TD-20/20 Luminometer ở các thời điểm 0h, 6h, 12h và 18h. Ở thời điểm 0h (mới bắt đầu nuôi lắc), mật độ tế bào và lượng phát quang là xấp xỉ bằng 0. Sau đó, mật độ tế bào và cường độ phát quang bắt đầu tăng dần. Lượng phát quang đạt cực đại ở thời điểm 12h và mật độ tế bào đạt cực đại ở thời điểm 18h (OD600nm ~ 1,8). Vào thời điểm 12h, khi lượng phát quang đạt cực đại, ta có thể quan sát sự phát quang sinh học của vi khuẩn V. harveyi bằng mắt thường. Sau thời điểm này, lượng phát quang giảm dần, và đến khoảng 18h sau thời điểm nuôi cấy, không thể quan sát sự phát quang sinh học của V. harveyi bằng mắt thường.
Hình 3.1. Đồ thị mơ tả sự tƣơng quan giữa giá trị OD600nm và lƣợng phát quang của Vibrio harveyi tại các thời điểm 0h, 6h, 12h và 18h.
Tóm lại, khi mật độ tế bào thấp, lượng phát quang đo được rất thấp, các tế bào liên lạc với nhau ít và có lẽ khơng đủ để tạo sự phát quang nhận biết bằng mắt thường. Khi mật độ tế bào tăng dần và đạt cực đại, các phân tử tín hiệu sinh ra bởi
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 0h 6h 12h 18h OD600nm Cường độ phát quang Cƣờn g độ phát quan g OD60 0nm Thời gian
các tế bào thơng qua quá trình quorum sensing, hoạt hoá sự phiên mã của các gen sản xuất các enzyme luciferase dẫn đến phát quang sinh học. Lúc này, lượng phát quang đo được rất cao và quan sát bằng mắt thường trong bóng tối có thể nhận biết được hiện tượng phát sáng này ở Vibrio harveyi.
3.2. Phân lập và tuyển chọn một số vi sinh vật có khả năng ức chế quá trình phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi 3.2.1. Phân lập các vi sinh vật ở các vùng ao nuôi tôm, rừng ngập mặn, đất, bùn của tỉnh Nam Định và Ninh Bình.
Để thu thập được nguồn vi sinh vật có hoạt tính ức chế quá trình phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn Vibiro harveyi gây bệnh trên
động vật thuỷ sản, từ 30 mẫu đất và bùn ở các vùng rừng ngập mặn, đất bìa rừng, đầm, bùn đáy ao nuôi tôm,… thu thập được ở các tỉnh Nam Định và Ninh Bình, chúng tơi tiến hành phân lập vi sinh vật, sau đó tinh sạch và các chủng này sẽ được đem thử hoạt tính ức chế phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi trong điều kiện invitro nhằm tìm ra những chủng vi sinh vật
có hoạt tính ức chế tốt.
Bảng 3.1. Số chủng vi sinh vật phân lập đƣợc từ 2 tỉnh Nam Định và Ninh Bình
TT Địa điểm thu mẫu Số mẫu thu thập Số chủng VSV phân lập đƣợc
1 Nam Định 20 140
2 Ninh Bình 10 159
Tổng số 30 299
Trong tổng số 30 mẫu thu thập tại 2 tỉnh Nam Định và Ninh Bình, có 299 chủng thu được (đều là vi khuẩn) trên môi trường LB 3% NaCl, khoảng 34 chủng mọc trên môi trường TCBS.
3.2.2 Xác định khả năng ức chế sự phát sáng liên quan đến quorum sensing ở
Vibrio harveyi của các vi sinh vật phân lập
3.2.2.1. Khả năng ức chế sự phát sáng ở Vibrio harveyi của các vi sinh vật phân lập đƣợc
Để xác định hoạt tính ức chế sự phát sáng liên quan đến quorum sensing ở
Vibrio harveyi của các vi khuẩn đã phân lập được, chúng tôi tiến hành thử hoạt tính
theo phương pháp ở mục 2.3.1.2.
Các chủng thu được đem thử hoạt tính trên đĩa 96 giếng và mức độ phát sáng của V. harveyi được quan sát bằng mắt thường ở thời điểm 6h, 12h và 18h. Ở thời điểm 12h sau khi tiến hành thí nghiệm, chúng tơi thu được 2 chủng (trong đó có 1 chủng phân lập từ mẫu đất Cúc Phương, Ninh Bình và 1 chủng phân lập từ mẫu đất Xuân Thuỷ, Nam Định) có khả năng ức chế sự phát sáng của Vibrio harveyi. Các
giếng đối chứng chỉ chứa môi trường và các giếng chứa môi trường chứa VSV được thử hoạt tính đều khơng sáng, cịn giếng đối chứng chỉ có Vibrio harveyi sáng rất mạnh. Còn ở các thời điểm 6h và 18h sau khi tiến hành thí nghiệm trên, quan sát bằng mắt thường trong bóng tối thì các giếng thí nghiệm đều khơng sáng. Kết quả ở mục 3.1 cho thấy, ở các thời điểm 6h và 18h, sự phát quang của V. harveyi không
đạt mức độ cực đại. Như vậy, thời điểm lý tưởng để quan sát bằng mắt thường sự phát quang của Vibrio harveyi là khoảng 12h sau khi tiến hành thí nghiệm trên.
Bảng 3.2. Kết quả phân lập đƣợc một số chủng vi khuẩn nghi ngờ có hoạt tính ức chế sự phát quang sinh học ở Vibrio harveyi
Kí hiệu chủng
Giếng chứa dịch nuôi (Độ sáng sau 12h)
Giếng 1 Giếng 2 Giếng 3 Giếng 4
CP1 + Vh + + + +
XTS1 + Vh - - - -
Chỉ có Vh +++ +++ +++ +++
Ghi chú: Các kí hiệu gồm có:
XTS1 + Vh: Giếng chứa môi trường + XTS1 + Vibrio harveyi
Sáng mạnh: (+++) Sáng yếu: (+) Không sáng: (-) Các giếng 1,2,3,4 là các giếng lặp lại cùng 1 thí nghiệm.
Hình 3.2. Kết quả thử hoạt tính ức chế phát quang sinh học ở Vibrio harveyi của các chủng XTS1, CP1, CP10. Các giếng đối chứng không phát sáng: giếng chỉ
có XTS1 (XTS1), giếng chỉ có CP1 (CP1); CP10 (CP10), giếng chỉ có mơi trường (MT). Giếng đối chứng phát sáng: chỉ có Vibrio harveyi (Vh). Giếng CP1 + Vh, CP10 + Vh, XTS1 + Vh lần lượt là hỗn hợp dịch nuôi loại tế bào của CP1, CP10,
XTS1 và dịch tế bào V. harveyi. Giếng 1, 2, 3, 4 lặp lại cùng 1 thí nghiệm. Như vậy, sau khi thử hoạt tính của các chủng vi khuẩn phân lập được trên đĩa 96 giếng, cũng thu được 2 chủng nghi ngờ có hoạt tính ức chế sự phát quang sinh học của Vibrio harveyi (các giếng sáng yếu, không sáng so với đối chứng Vibrio harveyi sáng mạnh); đó là các chủng XTS1 và CP1 (Bảng 3.2, Hình 3.2)
3.2.2.2. Kiểm tra khả năng ức chế sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn đối kháng
Để kiểm tra bản chất hoạt tính ức chế của 2 chủng này là ức chế sinh trưởng hay thực sự là ức chế sự phát sáng của Vibrio harveyi (liên quan đến quorum
sensing), chúng tơi tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu đồ thị sinh trưởng và sau đó dùng phương pháp cấy vạch vng góc để thử hoạt tính ức chế sinh trưởng (tạo
1 2 3 4
vịng vơ khuẩn) của dịch ni 2 chủng vi khuẩn XTS1 và CP1 với Vibrio harveyi.
+ Nghiên cứu đồ thị sinh trưởng của vi khuẩn Vibrio harveyi, XTS1 và CP1
Tiến hành đo mật độ tế bào (OD600nm) ở các thời điểm 1h, 2h, 5h, 6h sau khi nuôi cấy từ dịch tế bào đã nuôi lắc qua đêm của các chủng VSV này trong môi trường LB 3% NaCl mới. Kết quả thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Đồ thị sinh trƣởng của các chủng VSV.
Dựa vào đồ thị sinh trưởng của các chủng VSV cần đo, ta thấy tốc độ sinh trưởng của chủng XTS1 là nhanh nhất, sau đó đến Vibrio harveyi, CP1 và CP10,
một chủng đối chứng khơng có hoạt tính đối kháng (sai số ± 0.05). Tuy nhiên, sự chênh lệch về tốc độ sinh trưởng giữa các chủng VSV trên không quá nhiều.
+ Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế sinh trưởng của các chủng CP1 và XTS1 với Vibrio harveyi bằng phương pháp cấy vạch vng góc
Tiến hành thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế sinh trưởng của 3 chủng CP10, CP1 và XTS1 với V. harveyi (trong đó 2 chủng CP1 và XTS1 là 2 chủng
triển vọng có hoạt tính ức chế sự phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của Vibrio harveyi, còn chủng CP10 là chủng khơng có hoạt tính ức chế sự phát
quang sinh học) bằng phương pháp cấy vạch vng góc. Kết quả thể hiện trong hình 3.4. 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 1h 2h 4h 5h 6h Vibrio harveyi XTS1 CP1 CP10 OD60 0nm Thời gian
Hình 3.4. Kết quả khảo sát tính đối kháng giữa các chủng Vibrio harveyi và 3 chủng VSV phân lập đƣợc (CP10, CP1 và XTS1) bằng phƣơng pháp cấy vạch vng góc. Trong đó, Vh là kí hiệu của vi khuẩn Vibrio harveyi.
Đường cấy của Vibrio harveyi (Vh) với lần lượt các chủng CP10 (đối chứng khơng có hoạt tính), XTS1, CP1 mọc sát nhau chứng tỏ giữa Vibrio harveyi và 3
chủng này có khả năng tương thích với nhau (hình 3.4). Do đó, các chủng XTS1, CP1 không ức chế sinh trưởng của Vibrio harveyi. Như vậy, hai chủng vi khuẩn
XTS1 và CP1 có hoạt tính ức chế sự phát sáng liên quan đến quorum sensing của
Vibrio harveyi mà không ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn này.
+ Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế sinh trưởng của các chủng CP1 và XTS1 với Vibrio harveyi bằng phương pháp đục lỗ thạch
Trong hình 3.5, sau khi cấy trải V. harveyi trên bề mặt thạch, dịch môi trường khơng có vi khuẩn (MT), dịch ni của XTS1 và CP1 được nhỏ vào lỗ thạch đã đục. Kết quả cho thấy khơng có vịng vô khuẩn của V. harveyi gây ra bởi đối
chứng (môi trường), dịch nuôi của XTS1. Như vậy, dịch nuôi của các chủng vi khuẩn XTS1, CP1 không ức chế sự sinh trưởng của V. harveyi, hay nói một cách
Hình 3.5. Kết quả khảo sát sự ức chế sinh trƣởng giữa các chủng XTS1 và CP1 với V.harveyi bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch. Trong đó, MT là đối chứng mơi trƣờng LB 3% lỏng khơng có vi khuẩn.
Từ các kết quả kiểm tra khả năng ức chế sinh trưởng của các chủng VSV đối kháng, có thể kết luận rằng các chủng vi khuẩn XTS1, CP1 có khả năng ức chế phát quang sinh học mà không ức chế sự sinh trưởng của Vibrio harveyi.
3.3. Kết quả phân tích định lƣợng khả năng ức chế sự phát sáng liên quan đến quorum sensing ở Vibrio harveyi của các VSV phân lập đƣợc quorum sensing ở Vibrio harveyi của các VSV phân lập đƣợc
Để xác định rõ kết quả thu được, tiến hành đo cường độ phát quang từ các giếng thí nghiệm bằng máy TD-20/20 Luminometer. Kết quả đo được biểu thị trong hình 3.6.
Từ đồ thị biểu thị cường độ phát quang đo ở các giếng thí nghiệm trong hình 3.6, có thể nhận thấy sau khi bổ sung dịch nuôi loại tế bào của chủng vi khuẩn XTS1 vào các giếng mơi trường chứa Vibrio harveyi thì cường độ phát quang đo được là thấp nhất. Cường độ phát quang của Vibrio harveyi ở giếng bổ sung dịch
nuôi của chủng vi khuẩn CP1 cũng giảm khá thấp. Cịn giếng bở sung dịch ni của chủng vi khuẩn CP10 cường độ phát quang thay đổi không đáng kể.
Hình 3.6. Đồ thị biểu thị cƣờng độ phát quang của Vibrio harveyi ở các giếng thí nghiệm xác định khả năng ức chế sự phát sáng liên quan đến quorum sensing ở V. harveyi của các VSV phân lập đƣợc. Các cột có chữ cái khơng giống
nhau thể hiện sự sai khác thống kê với P ≤ 0.05.
Hình 3.7. Hiệu quả ức chế phát quang sinh học ở Vibrio harveyi của hai chủng vi khuẩn XTS1 và CP1
Phân tích hiệu quả ức chế phát quang sinh học của 2 chủng vi khuẩn XTS1 và CP1 cho kết quả như hình 3.7. Kết quả chỉ ra chủng XTS1 có hiệu quả ức chế lên
a b c d 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Vh + XTS1 Vh + CP1 Vh + CP10 Vh XTS1 + Vh CP1 + Vh 83.33±0.5 35±0.5 Hiệu quả ức chế (%) Hiệu quả ức chế (%) Cƣờ ng độ phát quan g
đến 83,33% (± 0.5), còn hiệu quả ức chế của chủng CP1 là 35% (±0.5) ở cùng thời điểm đo. Như vậy, 2 chủng vi khuẩn XTS1 và CP1 đều có hoạt tính ức chế sự phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi chủng
dại.
Từ kết quả phân lập và xác định khả năng ức chế phát quang sinh học cho thấy tỷ lệ các chủng vi sinh vật có hoạt tính ức chế quorum sensing của Vibrio harveyi trong tự nhiên còn thấp (299 chủng chỉ có 2 chủng có hoạt tính đối kháng).
Do đó, việc phân lập, tìm kiếm các chủng có hoạt tính ức chế sự phát sáng (liên quan đến quorum sensing) của vi khuẩn Vibrio harveyi là cần thiết.
3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số điều kiện môi trƣờng tới khả năng ức chế sự phát sáng ở Vibrio harveyi của các chủng VSV đối kháng chế sự phát sáng ở Vibrio harveyi của các chủng VSV đối kháng
3.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Tiếp theo chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng phát sáng của Vibrio harveyi sau khi được bổ sung với dịch nuôi loại tế bào của 2 chủng vi khuẩn có hoạt tính là XTS1 và CP1 ở các nhiệt độ khác nhau.
Bảng 3.3 . Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng ức chế sự phát quang sinh học ở Vibrio harveyi của các chủng XTS1 và CP1.
Giếng Nhiệt độ Vh Vh + XTS1 Vh + CP1 20C + - - 26C +++ - + 32C +++ - + 35C +++ - +
Ghi chú: Các kí hiệu: Vh + XTS1: giếng chứa Vibrio harveyi và dịch nuôi vi
khuẩn loại tế bào của XTS1. Vh + CP1: giếng chứa Vibrio harveyi và dịch nuôi vi khuẩn loại tế bào của CP1. ĐC: giếng đối chứng chỉ chứa Vibrio harveyi.
Rất sáng: (+++) Sáng mạnh: (++)
Sáng yếu: (+) Không sáng: (-)
Kết quả cho thấy, độ sáng của Vibrio harveyi không thay đổi ở các điều kiện nhiệt độ 26C, 32C và 35C (giếng đối chứng chỉ chứa Vibrio harveyi – ĐC), tuy nhiên ở 20C, vi khuẩn này hoạt động kém và phát sáng yếu. Hoạt tính ức chế sự phát sáng ở Vibrio harveyi của các chủng XTS1 và CP1 ở 4 điều kiện nhiệt độ này khi quan sát bằng mắt thường là khơng thay đởi. Các giếng chứa V. harveyi có bở
sung dịch nuôi của XTS1 đều không sáng khi quan sát ở thời điểm khoảng 12h (thời điểm Vibrio harveyi phát sáng mạnh nhất) sau khi tiến hành thí nghiệm. Cịn các
giếng có bở sung dịch nuôi của CP1 khi quan sát bằng mắt thường cũng không thay đổi và đều cho ánh sáng yếu hơn giếng (ĐC) chỉ chứa Vibrio harveyi.
3.4.2 Ảnh hƣởng của độ pH môi trƣờng nuôi cấy
Vi khuẩn Vibrio harveyi gây bệnh phát sáng trên tôm thường sinh sống trong điều kiện môi trường kiềm. Ở điều kiện in vitro, với pH <6, pH ≥10, vi khuẩn này khơng phát triển. Để tìm hiểu khả năng ức chế của 2 chủng XTS1 và CP1 đối với sự phát sáng của loài vi khuẩn này trên các điều kiện pH khác nhau (6.5, 8 và 9), chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo mục 2.3.2.3. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng tới khả năng ức chế phát quang sinh học liên quan đến QS ở Vibrio harveyi của 2 chủng vi khuẩn XTS1 và CP1
Giếng Độ pH Vh Vh + XTS1 Vh + CP1 6.5 ++ - ++ 8 +++ - + 9 +++ - ++
Ghi chú: Các kí hiệu: Vh + XTS1: giếng chứa Vibrio harveyi và dịch nuôi vi
khuẩn loại tế bào (DN) của XTS1. Vh + CP1: giếng chứa Vibrio harveyi và dịch
nuôi vi khuẩn loại tế bào (DN) của CP1. ĐC: giếng đối chứng chỉ chứa Vibrio harveyi.
Rất sáng: (+++) Sáng mạnh: (++)
Sáng yếu: (+) Không sáng: (-)
Sau khi tiến hành thí nghiệm khoảng 12h, chúng tôi quan sát bằng mắt thường độ sáng của các giếng. Kết quả cho thấy, ở pH 6.5, vi khuẩn Vibrio harveyi phát sáng kém hơn các giếng chứa môi trường LB 3% ở mức pH 8 và 9. Trong khi đó, chủng vi khuẩn XTS1 đều ức chế hiệu quả sự phát sáng của Vibrio harveyi ở
các pH 6.5, 8 và 9 (các giếng đều khơng sáng). Cịn chủng CP1 ức chế kém hiệu quả ở điều kiện pH môi trường 6.5 (các giếng đều sáng mạnh giống giếng đối chứng) và ở mức pH 8 và 9, CP1 ức chế khá hiệu quả sự phát sáng của Vibrio harveyi (độ sáng yếu hơn giếng đối chứng).
Như vậy, độ pH của mơi trường ni cấy có ảnh hưởng đến sự phát sáng của
Vibrio harveyi. Đặc biệt, ở điều kiện pH 6.5, vi khuẩn này phát sáng yếu hơn. Cũng