CHƢƠNG 2 THỰC NGHIỆM
2.3. Hóa chất và thiết bị
2.3.1. Hóa chất
Tất cả các hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tìch và đƣợc pha chế bằng nƣớc deion.
2.3.1.1. Chất chuẩn
- MA (Lipomed, hàm lƣợng dạng bazơ =80,2%) - MDA (Lipomed, hàm lƣợng dạng bazơ = 82,8%) - MDMA (Lipomed, hàm lƣợng dạng bazơ = 83,71%) - MDEA (Lipomed, hàm lƣợng dạng bazơ = 84,66%)
2.3.1.2. Hóa chất, dung mơi
- L- Arginine (C6H14N4O2) (Fluka, hàm lƣợng > 99,5%)
- Axit acetic (CH3COOH), (PA, Merck, Đức) - Axit clohydric (HCl), (PA, Merck, Đức)
- Axit photphoric (H3PO4) (PA, Deajung, Hàn Quốc, 85%)
- Natri hydroxyd (NaOH), (PA, Merck, Đức) - Methanol (CH3OH), (PA, Merck, Đức)
- Etyl axetat (CH3COOC2H5), (PA, Deajung, Hàn Quốc, >99,9%)
- 2-propanol (C3H8O), (PA, Deajung, Hàn Quốc, >99,8%) - Diclometan (CH2Cl2), (PA, Deajung, Hàn Quốc, 99%)
* Pha các dung dịch chuẩn gốc
Cân chình xác từng chất phân tìch trên cân phân tìch (độ chình xác 0,1mg): 0,0125 g MA, 0,0121 g MDA, 0,0119 g MDMA, 0,0118 g MDEA chuyển vào bính định mức 10,0 mL, thêm 4 mL Methanol và đem rung siêu âm 30 phút sau đó định mức đến vạch bằng nƣớc deion ta đƣợc các dung dịch chuẩn gốc 1000ppm.
Các dung dịch chuẩn nồng độ nhỏ hơn đƣợc pha loãng bằng nƣớc deion theo tỉ lệ thìch hợp từ dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm trƣớc khi phân tìch.
* Pha dung dịch đệm điện di
Dung dịch pha động điện di kết hợp giữa Arginine và axit acetic đƣợc pha nhƣ sau: Cân chình xác 0,0435g Arginine chuyển vào cốc có mỏ 50,0 mL rung siêu âm trong 5 phút cho tan hết sau đó thêm từ từ axit axetic vào đến khi pH của dung dịch là 4.5 (sử dụng máy đo pH). Dung dịch đệm đƣợc pha mới hàng ngày.
2.3.2. Thiết bị, dụng cụ
*Thiết bị
- Thiết bị điện di mao quản CE-C4D nhƣ đã trính bày ở mục 2.2.1. - Thiết bị lọc nƣớc deion (Mỹ).
- Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng BRANSONIC 521.
- Máy đo pH của hãng HANNA với điện cực thủy tinh và các dung dịch pH chuẩn để hiệu chỉnh điểm chuẩn của máy đo pH.
- Cân phân tìch của hãng S¢ientech (Mỹ), độ chình xác 0,1mg. - Tủ lạnh Sanaky VH-2899W dùng bảo quản mẫu
Dụng cụ:
- Dụng cụ thủy tinh: bính định mức, pipet, cốc, ống nghiệm. - Pipet paster các loại: 10; 20; 100; 200; 5000 µL.
- Các lọ Falcon 15ml để đựng dung dịch chuẩn.
2.4. Các phƣơng pháp đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích 2.4.1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) của thiết bị
Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tìch mà hệ thống phân tìch cịn cho tìn hiệu phân tìch khác có nghĩa so với tìn hiệu mẫu trắng hay tìn hiệu nền [9].
Thơng thƣờng, đối với các q trính sắc kì, LOD là nồng độ nhỏ nhất mà cho tìn hiệu/nhiễu (S/N) bằng 3.
Giới hạn định lƣợng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tìch mà hệ thống phân tìch định lƣợng đƣợc tìn hiệu phân tìch khác có ý nghĩa định lƣợng với tìn hiệu mẫu trắng hay tìn hiệu của nền. Với các quá trính sắc ký, giá trị LOD đƣợc xác định theo tỉ số tìn hiệu/nhiễu (S/N) bằng 10.
2.4.2. Độ chụm (độ lặp lại) của phƣơng pháp
- Độ lặp lại đặc trƣng cho mức độ gần nhau giữa các giá trị riêng lẻ xi khi tiến hành trên các mẫu thử giống hệt nhau, bằng cùng một phƣơng pháp phân tìch, trong cùng điều kiện thì nghiệm (cùng ngƣời phân tìch, trang thiết bị, phịng thì nghiệm) trong các khoảng thời gian ngắn. Do vậy còn gọi là độ chình xác trong phịng thì nghiệm [9].
- Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc xác định qua độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD%) theo các cơng thức sau:
RSD (%) cịn đƣợc gọi là hệ số biến thiên (CV%). Ngƣời ta thƣờng sử dụng độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) hơn là độ lệch chuẩn (SD) do có thể đánh giá đƣợc độ lệch chuẩn chiếm bao nhiêu phần trăm giá trị trung bính và có cái nhín rõ hơn về độ chụm của các số liệu trong tập số liệu lặp lại.
Trong đó:
- Si là diện tìch của pic điện di thứ i
- Stb là diện tìch trung bính của n lần phân tìch - n là số lần phân tìch lặp lại
2.4.3. Độ đúng (độ thu hồi) của thiết bị, của phƣơng pháp
Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bính của dãy lớn các kết quả thì nghiệm và các giá trị quy chiếu đƣợc chấp nhận. Do đó, thƣớc đo độ đúng thƣờng đánh giá qua sai số tƣơng đối hay bằng phƣơng pháp xác định độ thu hồi
[9]. Độ thu hồi (H): 100 lt tt C C H Trong đó:
H: hiệu suất thu hồi (%)
Ctt: Nồng độ thực tế của mỗi chất phân tìch thu đƣợc (tình theo đƣờng chuẩn)
Clt: Nồng độ lý thuyết của mỗi chất phân tìch tình tốn từ lƣợng chuẩn thêm vào. Nếu chất chuẩn thêm vào mẫu từ trƣớc khi xử lý mẫu thí sẽ cho độ đúng của phƣơng pháp, còn nếu chất chuẩn đƣợc thêm vào trƣớc khi bơm vào thiết bị CE thí sẽ cho độ đúng của thiết bị.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Phƣơng pháp (CE-C4D) đã đƣợc sử dụng để nghiên cứu tách và xác định đồng thời một số chất ma túy tổng hợp nhóm ATS [29] và bƣớc đầu đã đạt đƣợc một số kết quả về điều kiện tối ƣu phân tìch 4 chất ma túy MA, MDA, MDMA và MDEA. Tuy nhiên, do nền mẫu nƣớc tiểu phức tạp và hàm lƣợng các chất phân tìch trong nƣớc tiểu thƣờng rất nhỏ nên việc xử lý mẫu là rất cần thiết. Trong nghiên cứu này, chúng tơi tập trung vào quy trính xử lý mẫu nƣớc tiểu trên cơ sở kỹ thuật chiết lỏng - lỏng và chiết pha rắn nhằm nâng cao hiệu quả phân tìch bốn chất ma túy nhóm ATS nêu trên bằng phƣơng pháp CE-C4D. Các nội dung nghiên cứu cụ thể bao gồm: xây dựng và đánh giá lại đƣờng chuẩn, giá trị LOD, LOQ tại thời điểm nghiên cứu; khảo sát điều kiện tối ƣu xử lý mẫu nƣớc tiểu trên cơ sở kỹ thuật lỏng - lỏng và chiết pha rắn (SPE) nhằm nâng cao hiệu quả phân tìch; áp dụng phân tìch một số mẫu thực tế và tiến hành đối chứng với phƣơng pháp truyền thống (GC-MS) do Viện Khoa học Hính sự thực hiện.
3.1. Xây dựng đƣờng chuẩn của các chất phân tích 3.1.1. Xây dựng đƣờng chuẩn
Các dung dịch sử dụng để lập đƣờng chuẩn có nồng độ trong khoảng 5÷120 với MA và 10÷140ppm với MDA, MDAM, MDEA và đƣợc pha loãng từ các dung dịch chuẩn gốc ban đầu. Mỗi dung dịch đƣợc bơm 3 lần và thực hiện quá trính điện di trên thiết bị điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc với các điều kiện tối ƣu nhƣ sau:
- Mao quản silica đƣờng kình trong ID = 50 µm, tổng chiều dài: 60cm (chiều dài hiệu dụng 53cm).
- Phƣơng pháp bơm mẫu: Thủy động lực học kiểu xiphông ở độ cao 10 cm.
- Dung dịch đệm điện di: Arg/Ace (10 mM) pH = 4,5.
- Thế tách: 10 kV
- Giá trị diện tìch pic trung bính là kết quả đƣợc sử dụng để lập đƣờng chuẩn. Các kết quả đo đƣợc trính bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ MA, MDA, MDMA, MDEA
STT
MA MDA MDMA MDEA
Nồng độ (ppm) Diện tìch pic (mV.s) Nồng độ (ppm) Diện tìch pic (mV.s) Nồng độ (ppm) Diện tìch pic (mV.s) Nồng độ (ppm) Diện tìch pic (mV.s) 1 5,0 9,2 10,0 9,7 10,0 13,4 10,0 12,4 2 10,0 18,8 20,0 18,8 20,0 25,0 20,0 23,1 3 20,0 37,7 40,0 39,5 40,0 49,8 40,0 52,0 4 30,0 60,9 60,0 60,9 60,0 77,0 60,0 80,3 5 40,0 78,7 80,0 79,5 80,0 103,0 80,0 106,4 6 50,0 99,5 100,0 102,3 100,0 130,9 100,0 131,6 7 60,0 118,4 120,0 120,6 120,0 156,9 120,0 154,8
0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 Y = A + B * X Thông số Giá trị Sai sè ---------------------------------- A -0,96769 0,70455 B 1,01867 0,00976 ---------------------------------- R SD N P ---------------------------------- 0,99977 0,97987 7 <0.0001 D iƯn tÝc h pic (m V .s ) Nång ®é MDA (ppm)
Hình 3.1. Đƣờng chuẩn của MA Hình 3.2. Đƣờng chuẩn của MDA
0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Y = A + B * X Thông số Giá trị Sai sè ------------------------------------ A -1,27082 0,81591 B 1,31371 0,0113 ------------------------------------ R SD N P ------------------------------------ 0,99982 1,13475 7 <0.0001 D iÖ n tÝ c h p ic ( mV .s) Nång ®é MDMA (ppm) 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Y = A + B * X Th«ng sè Giá trị Sai số ------------------------------------- A -0,89037 1,44192 B 1,31822 0,01997 ------------------------------------- R SD N P ------------------------------------- 0,99943 2,00539 7 <0,0001 D iÖn tÝc h pic (m V .s ) Nång ®é MDEA (ppm)
Hình 3.3. Đƣờng chuẩn của MDMA Hình 3.4. Đƣờng chuẩn của MDEA
Tra bảng chuẩn t với bậc tự do f = 5, độ tin cậy 95% có t = 2,57, kết hợp với các giá trị a, b, Sa, Sb, Sy của các chất từ phần mềm origin 6.1 ta có phƣơng trính hồi quy của các chất phân tìch:
Bảng 3.2. Phƣơng trình hồi quy của các chất phân tích
Chất phân tìch Phƣơng trính hồi quy Hệ số tƣơng quan R2
MA y = (-0,9818±2,0367) + (2,0003±0,0564)x 0,9994 MDA y = (-0,9677±1,8107) + (1,0187±0,0251)x 0,9995 MDMA y = (-1,2708±2,0969) + (1,3137±0,0290)x 0,9989 MDEA y = (-0,8904±3,7057) + (1,3182±0,0513)x 0,9996 0 10 20 30 40 50 60 0 20 40 60 80 100 120 Y = A + B * X
Thông số Giá trị Sai sè
-------------------------------------- A -0,98187 0,79249 B 2,00034 0,02195 -------------------------------------- R SD N P -------------------------------------- 0,9997 1,10218 7 <0.0001 D iƯn tÝc h pic (m V .s ) Nång ®é MA (ppm)
Từ các kết quả trên cho thấy hệ số tƣơng quan R2 của các chất phân tìch đều lớn hơn 0,99 đồng thời giá trị P value<0,05 chứng tỏ x và y có quan hệ tuyến tình.
3.1.2. Đánh giá phƣơng trình hồi quy của đƣờng chuẩn
Trong phƣơng trính hồi quy y = a + bx, trƣờng hợp lý tƣởng xảy ra khi khơng có chất phân tìch thí khơng có tìn hiệu. Tuy nhiên, trong thực tế các số liệu phân tìch thƣờng mắc sai số ngẫu nhiên ln làm cho a ≠ 0.Nếu giá trị a khác 0 có ý nghĩa thống kê thí phƣơng pháp phân tìch mắc sai số hệ thống.Ví vậy, trƣớc khi sử dụng đƣờng chuẩn cho chất phân tìch cơng cụ thí cần kiểm tra sự khác nhau giữa giá trị a và 0 có ý nghĩa thống kê không.
* Kiểm tra a với giá trị 0:
Nếu xem a ≈ 0 thí phƣơng trính y = a + bx đƣợc viết thành y = b'x. Thay các
giá trị xi, yi vào phƣơng trính y = b'x ta sẽ đƣợc các giá trị b’i và tình
;
Phƣơng sai của hai phƣơng trính đƣợc tình nhƣ sau:
Bảng 3.3. Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của phƣơng trình đƣờng chuẩn MA, MDA, MDMA, MDEA
Chất S2y S'2y Ftình Fbảng MA 1,9380 1,0123 4,3963 4,3429 4,3874 MDA 0,9906 0,7836 3,3527 4,2786 4,3874 MDMA 1,2889 1,0730 2,6185 2,4404 4,3874 MDEA 1,2813 3,3513 9,4132 2,8088 4,3874
Từ kết quả trên cho thấy Ftình< Fbảng nghĩa là sự sai khác giữa giá trị a và 0 khơng có ý nghĩa thống kê hay phƣơng pháp không mắc sai số hệ thống.
Giới hạn phát hiện (LOD) của thiết bị đo
Giá trị LOD [9] là nồng độ thấp nhất của chất phân tìch trong mẫu có thể phát hiện đƣợc nhƣng chƣa thể định lƣợng đƣợc. Có thể xác định LOD của phƣơng pháp bằng nhiều cách khác nhau nhƣ: dựa trên độ lệch chuẩn, dựa trên tỷ lệ tìn hiệu trên nhiễu (S/N), hoặc dựa trên đƣờng chuẩn. Phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng cơng cụ có đƣờng nhiễu nền nên thƣờng xác định LOD của phƣơng pháp dựa trên tỷ lệ tìn hiệu trên nhiễu (S/N) theo bảng:
Bảng 3.4. Giới hạn phát hiện của MA, MDA, MDMA, MDEA xác định bằng phương pháp điện di mao quản CE-C4
D
Nồng độ
(ppm) Chất Chiều cao pic (S) (mV) Tìn hiệu nhiễu đƣờng nền (N) (mV) S/N 1,0 MA 0,5019 0,1235 4,06 2,5 MDA 0,3991 3,23 2,5 MDMA 0,4803 3,89 2,5 MDEA 0,4304 3,49 0,5 MA 0,4825 0,1528 3,15 1,0 MDA - - 1,0 MDMA - - 1,0 MDEA - -
Nhƣ vậy, giới hạn phát hiện xác định đƣợc từ thực nghiệm dựa trên tỷ số S/N của MA là 0,5 ppm và của các chất MDA, MDMA, MDEA là 2,5 ppm.
Giới hạn định lƣợng (LOQ)
Giới hạn định lƣợng là nồng độ của chất phân tìch cho tỷ lệ tìn hiệu/nền bằng 10. Từ đó ta có giới hạn định lƣợng của MA là 1,7 ppm và của các chất MDA, MDMA, MDEA là 8,3 ppm. Khoảng tuyến tình của các chất phân tìch có thể mở rộng hơn nữa. Tuy nhiên, với đối tƣợng mẫu sinh học (mẫu nƣớc tiểu), hàm lƣợng
của các chất phân tìch tƣơng đối nhỏ và để đảm bảo độ phân giải tốt giữa các chất phân tìch nên chúng tơi khơng tiếp tục khảo sát sự tuyến tình ở mức nồng độ cao hơn nữa [9].
Nhƣ vậy, chúng tôi xác định đƣợc khoảng tuyến tình của các chất phân tìch nhƣ trong bảng 3.5 dƣới đây:
Bảng 3.5. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ) của MA, MDA, MDMA, MDEA
Chất phân tìch Khoảng tuyến tình (ppm) LOD (ppm) LOQ (ppm)
MA 1,7 - 60 0,5 1,7
MDA 8,3 - 120 2,5 8,3
MDMA 8,3 - 120 2,5 8,3
MDEA 8,3 - 120 2,5 8,3
3.2.2. Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) của thiết bị
Để đánh giá độ chụm [9] của thiết bị, chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp lại của MA, MDA, MDMA và MDEA ở 3 mức nồng độ khác nhau. Mỗi mức nồng độ đƣợc tiến hành với 7 lần bơm mẫu độc lập. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.6. Kết quả xác định độ lặp lại của thiết bị CE-C4D trong định lƣợng MA
Lần bơm mẫu Diện tìch pic ở các mức nồng độ của MA 10,0 ppm 30,0 ppm 50,0 ppm
1 18,1 60,4 102,3
2 18,7 59,3 103,5
3 19,0 60,3 101,9
5 19,3 60,2 101,4
6 18,8 59,9 102,9
7 18,6 61,2 103,1
Spic trung bính 18,6 60,2 102,7
CV (%) 2,5 1,0 0,8
Bảng 3.7. Kết quả xác định độ lặp lại của thiết bị CE-C4D trong định lƣợng MDA
Lần bơm mẫu
Diện tìch pic ở các mức nồng độ của MDA 20,0 ppm 50,0 ppm 100 ppm 1 18,8 54,1 105,8 2 18,1 53,0 107,6 3 19,0 53,8 105,2 4 18,5 53,2 110,1 5 19,3 54,0 106,7 6 19,1 54,6 105,7 7 18,8 55,0 109,3