1.4 PIN NHIÊN LIỆU VI SINH VẬT
1.4.3 Vật liệu tạo khung cho MFC
Vật liệu tạo khung cho MFC giúp tạo hình dáng và ngăn cách khoang phản ứng anode và cathode của MFC với điều kiện mơi trƣờng bên ngồi. u cầu của vật liệu tạo khung MFC là: không độc với hệ vi sinh vật, không bị phản ứng hay bị ăn mịn với hóa chất thử nghiệm, có thể khử trùng đƣợc. Có rất nhiều vật liệu đã đƣợc báo cáo sử dụng cho việc làm khung MFC, ví dụ nhƣ thủy tinh, polyacrylic, polyplastic, polypropylen, plexiglass…[37, 38]
Hình 9: MFC hai khoang-khung thủy tinh [38] tinh [38]
Hình 10: MFC một khoang-khung thủy tinh [38] thủy tinh [38]
Vật liệu thủy tinh phục vụ cho làm khung MFC: Thủy tinh (bao gồm cả
plexiglass) có thể đáp ứng đƣợc những yêu cầu cơ bản của một vật liệu tạo khung cho MFC. Đây là các vật liệu rất tốt để phục vụ cho việc nghiên cứu về hệ vi sinh vật trong MFC, hay để thử nghiệm các nguồn cơ chất mới [38]. Tuy nhiên, vật liệu này bộc lộ nhiều hạn chế khi cần chế tác, thay đổi cấu trúc.
Vật liệu polyacrylic: Đây cũng là một vật liệu phổ biến đƣợc sử dụng trong
nghiên cứu MFC. Do tính chất dẻo của polyacrylic, ta có thể dễ dàng chế tác và sửa chữa vật liệu theo cấu trúc, thiết kế mong muốn. Hơn nữa, vật liệu này có giá thành khơng đắt, dễ dàng sản xuất, và có thể khử trùng đƣợc [38].
Hình 11: MFC một khoang- khung polyacrylic [38] polyacrylic [38]
Hình 12: MFC hai khoang- khung polyacrylic [38] polyacrylic [38] Hình 13: MFC dạng ống- khung polypropylen [60] Hình 14: MFC một khoang- khung Plexiglas [38] 1.4.4 Ứng dụng của MFC
MFC trong sản xuất điện: MFC có khả năng chuyển hóa năng lƣợng hóa học
trong thành phần hóa học của sinh khối thành năng lƣợng điện tích với sự có mặt của vi khuẩn, bởi các năng lƣợng hóa học bị oxy hóa đƣợc tạo thành dịng điện thay cho phản ứng sinh nhiệt. Chaudhury và Lovley đã báo cáo rằng R. ferrireducens có thể phát sinh dịng điện với sản lƣợng đạt 80%, sự chuyển hóa cao hơn khoảng 89% đã đƣợc báo cáo bởi Rabaey và cộng sự 2003, hay đạt 97% với điện cực bọc bởi Pt
điện tích bị dự trữ trong thiết bị và sự phân bổ điện tích là khơng đều [15, 18, 37, 38].
MFC trong sản xuất hydro sinh học: MFC có thể đƣợc sử dụng để sản xuất
hydrogen thay cho điện. Dƣới điện kiện hoạt động bình thƣờng, proton đƣợc giải thoát bởi các phản ứng khoang anode di chuyển tới khoang cathode kết hợp với oxy tạo ra nƣớc. Nếu cung cấp thêm một lƣợng điện thế nhỏ ở cathode thì có thể thu đƣợc hydro. MFC có thể sản xuất 8 – 9 mol H2/ mol glucose trong khi các quá trình lên men chỉ sản xuất 4 mol H2/ mol glucose [38].
MFC trong xử lý nước thải: MFC đã đƣợc ứng dụng trong xử lý nƣớc thải từ
rất sớm vào năm 1991 bởi Habermann và Pommer. Năng lƣợng phát sinh của MFC trong xử lý nƣớc thải có thể đƣợc tạo ra từ q trình tiêu thụ cơ chất của vi sinh vật, và các phân tử hữu cơ nhƣ acetate, propionate, butyrate có thể đƣợc phân hủy thành CO2 và H2O. MFC dạng đơn và MFC thiếu màng đƣợc sử dụng cho xử lý nƣớc thải có thể phân hủy đƣợc hơn 80% lƣợng chất hữu cơ [15, 37, 38, 49].
MFC sử dụng làm cảm biến sinh học: Một ứng dụng khác của MFC hiện nay
đang đƣợc quan tâm nghiên cứu là sử dụng làm cảm biến sinh học cho phân tích các chất gây ô nhiễm và chỉ thị kiểm sốt chúng. Việc phát sinh dịng điện có mối quan hệ với nồng độ chất hữu cơ trong nƣớc nƣớc thải và điều này rất thuận lợi cho việc thiết kế cảm biến đo BOD (BOD sensor). Nhờ vậy, ta có thể dùng hệ thống MFC nhƣ một cảm biến chỉ thị trực tiếp nồng độ BOD trong nƣớc thải. Ngoài ra, hệ thống MFC có thể sử dụng làm cảm biến phát hiện độc tố, dựa vào sự ức chế cơ chế di chuyển electron hoặc quá tình trao đổi chất của vi khuẩn bởi các thành phần độc tố có trong mơi trƣờng [13, 17, 23, 25, 26, 29, 32, 35, 36, 55].
1.5 HỆ VI SINH VẬT TRONG MFC
Nhƣ ta đã biết, MFC là hệ thống sử dụng vi sinh vật chuyển hóa năng lƣợng hóa học từ các hợp chất hữu cơ thành dòng điện. Nhiều nghiên cứu về hệ vi sinh vật trong anode của MFC nhận thấy rằng, có tới bốn trong năm lớp của Proteobacteria
có khả năng phát sinh dòng điện (Deltaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Betaproteobacteria); hay Bacteroidetes; Acidobacteria, Firmicutes. Nấm men Pichia anomala và vi khuẩn lam Synechocytis sp. PCC 6803
cũng đã đƣợc phát hiện ra là có khả năng sản xuất dòng điện trong MFC. Một nghiên cứu của Kim và công sự đã công bố cấu trúc hệ vi khuẩn hoạt động trong MFC bằng phƣơng pháp phân tích thƣ viện nhân dịng gen 16s rRNA đã nhận thấy rằng, Bacteriodetes chiếm số lƣợng lớn với 32,5 % trong tổng số trình tự nhân
dịng, tiếp đến là Betaproteobacteria là 23,9 %; Firmicutes 14,2 %; Grammaproteobacteria 10,6 %; Alphaproteobacteria 6,9 %; Spirochaetes 5.9 %; Acidobacteria 2,6 %; Deltaproteobacteria và Planctomycetes chiếm 0,3 %; và các
trình tự chƣa định danh đƣợc chiếm 1.3%. Một nghiên cứu khác của Choo và công sự (2006) lại chỉ ra rằng lớp vi khuẩn chiếm ƣu thế tròng MFC đƣợc làm giàu với nồng độ glucose và glutamate là Grammaproteobacteria (36,5%), mặt khác Logan
và Regan (2006) lại tìm thấy lớp Sigmaproteobacteria là chiếm ứu thế trong quần xã vi sinh vật điện hóa trong MFC và chúng có trình tự tƣơng đồng gen 16s rRNA lớn hơn 95% với loài Desulfuromonas acetoxidans. Geobacter sulfurreducens và Shewanella oneidensis là các vi khuẩn điện hóa điển hình đƣợc tìm thấy trong nhiều
hệ thống MFC và tƣơng tác của chúng với điện cực trong MFC đã đƣợc nghiên cứu kỹ (Bảng 6). Bên cạnh đó, trong một số hệ thống khác, các vi khuẩn thuộc chi
Pseudomonas đƣợc phát hiện và khả năng tƣơng tác của chúng với điện cực thông
qua chất truyền điện tử trung gian tự sinh đã đƣợc chứng minh Ngoài ra, rất nhiều lồi vi khuẩn thơng qua ni cấy đơn chủng trong MFC đã đƣợc chứng minh là có khả năng sinh ra dịng điện (Bảng 6) [16, 27, 39, 41].
Bảng 6: Các chủng vi khuẩn điện hóa trong MFC khơng sử dụng chất truyền điện tử trung gian [39, 43, 50]
Năm phát hiện Vi khuẩn
1999 Shewanella putrefaciens IR-1 2001 Clostridium butyricum EG 3 2002 Desulfuromonas acetoxidans Geobacter metallireducens 2003 Geobacter sulfurreducens Rhodoferax ferrireducens Aeromonas hydrophila 2004 Pseudomonas aeruginosa Desulfobulbus propionicus 2005 Geopsychrobacter electrodiphilus 2006 Shewanella oneidensis DSP 10 S. oneidensis MR-1 Escherichia coli 2008 Rhodopseudomonas palustris DX-1
Ochrobactrum anthropi YZ-1 Desulfovibrio desulfuricans Acidiphilium sp. 3.2Sup5 Klebsiella pneumoniae L17 Thermincola sp. JR Pichia anomala 2009 Bacillus subtilis 2013 Tolumonas osonensis
Ảnh hưởng của vi sinh vật tới hoạt động của MFC: Nhƣ ta đã biết MFC hoạt
động dựa trên quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Do đó, sự phát triển của vi sinh vật trong MFC, nguồn vi sinh vật sử dụng làm giàu, hay phƣơng thức làm giàu đóng một vai trị quan trọng đến sự phát sinh dòng điện, điều kiện hoạt động, và năng lƣợng thu đƣợc của MFC. Một vài nghiên cứu đã chỉ ra rằng, những MFC đƣợc làm giầu từ nguồn vi sinh vật hỗn hợp có thể cho dịng điện lớn hơn so với làm giàu đơn
chủng. Logan đã báo cáo rằng MFC đƣợc làm giàu từ quần xã có cơng suất lớn hơn 22% (576 mW/m2) so với MFC làm giàu từ chủng Geobacter sulfurreducens. Ngoài ra, các quần xã vi sinh vật khác nhau có thể ảnh hƣởng tới điện trở trong của MFC. Ví dụ, Ana và cộng sự (2011) đã công bố với MFC làm giầu từ quần xã khử lƣu huỳnh có điện trở trong 2550 ohm, trong khi các quần xã methanol và quần xã hiếu khí có điện trở trong lần lƣợt là 6400 ohm và 115000 ohm. Hơn nữa, công suất đầu ra và điều kiện hoạt động của MFC còn bị giới hạn bởi tốc độ sinh trƣởng và mối quan hệ của các chủng vi sinh vật trong quần xã. Một bằng chứng là trƣờng hợp chủng vi khuẩn khuẩn Gram dƣơng Brevibacillus sp. PHT1 có thể chuyền điện tử ngoại bào nhờ có hoạt động trao đổi chất của Pseudomonas sp [27, 39, 41, 57, 67].
1.6 CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT TRONG MFC
Phƣơng pháp phổ biến sử dụng nghiên cứu quần xã vi sinh vật là phƣơng pháp phân lập-nuôi cấy truyền thống. Tuy nhiên, việc phân loại và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật dựa trên nuôi cấy cịn nhiều hạn chế, vì các vi sinh vật có kích thƣớc nhỏ bé, dẫn đến sự khó khăn trong phân biệt hình thái của chúng; và vì số lƣợng vi sinh vật ni cấy đƣợc là rất thấp. Theo một số nghiên cứu gần đây, chỉ có khoảng 1% các chủng vi khuẩn là ta có thể phân lập đƣợc bằng các phƣơng pháp ni cấy hiện có [7, 46].
Gần đây, các phƣơng pháp sinh học phân tử đã đƣợc áp dụng để phân tích quần xã vi sinh vật nhƣ: RFLP (đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn), RADP (phân đoạn DNA đa hình đƣợc khuếch đại ngẫu nhiên), DGGE (Điện di gel biến tính-denaturing gradient gel electrophoresis). DGGE là phƣơng pháp phân tách các đoạn DNA có chiều dài tƣơng đồng nhau nhƣng khác nhau về trình tự sắp xếp, sự phân tách này dựa trên sự giảm tốc độ di chuyển của các sợi DNA đơi có thành phần khác nhau, bị biến tính trong gel polyacrylamide với nồng độ chất biến tính tăng dần (chất biến tính là hỗn hơn urea và formamide), qua đó chúng sẽ dừng lại tại các điểm khác nhau trên gel. Nhằm tăng độ đặc hiệu quá trình phân tách các đoạn DNA có trình tự khác nhau, đầu cuối 5’ của đoạn DNA đƣợc thêm vào trình tự
thƣờng các kẹp GC thƣờng có độ dài từ 30-50 nucleotide. DGGE đã đƣợc sử dụng trong: phân tích quần xã vi sinh vật, chỉ dẫn sự thay đổi của quần thể vi sinh vật, phát hiện các trình tự DNA khơng tƣơng đồng….[46-48, 64].
DGGE tỏ ra đặc biệt hiệu quả khi sử dụng để phân tích so sánh trình tự gen 16s rRNA của vi khuẩn. Trình tự 16s rRNA đƣợc sử dụng rộng rãi trong phân loại vi khuẩn. Vùng 16s rRNA có 9 vùng biến động (ký hiệu từ V1-V9), đã đƣợc chứng minh là có mức độ đa dạng trình tự cao giữa các vi khuẩn khác nhau và có thể sử dụng cho phân loại các lồi. Ví dụ, vùng V2 và V3 có kích thƣớc khoảng 200 bp có khả năng phân biệt đƣợc 110 loại vi khuẩn khác nhau tới mức độ chi. Tuy nhiên, các vùng này thƣờng ngắn và không thể chỉ sử dụng một vùng biến động mà có thể phân biệt đƣợc tất cả các loại vi khuẩn [12, 47].
Chƣơng 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
Nghiên cứu này đƣợc thực hiện tại Phịng thí nghiệm bộ môn Vi sinh vật học - Khoa Sinh học, Trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên, sử dụng các máy móc, thiết bị chun mơn dùng trong nghiên cứu vi sinh vật học, Sinh học phân tử đạt tiêu chuẩn:
- Máy PCR 9700 (Applied Biosystems, Mỹ). - Máy ly tâm 5417R (Eppendorf, Đức) - Máy điện di ngang (BioRad, Mỹ)
- Máy DGGE K-2401 (C.B.S Scientific, Mỹ) - Bàn soi gel LMW-20 UVP (UK).
- Kính hiển vi quang học (Zeiss, Đức)
Hóa chất sử dụng cho nuôi cấy vi sinh vật: Pepton, các muối (NaCl, MgSO4, (NH4)2SO4, K2HPO4, KH2PO4…); nguyên tố vi lƣợng (H3BO3, CoCl2.6H2O...) có xuất xứ Trung Quốc (Xilong), Agar (Việt Nam), Cao nấm men (Sigma, Hoa Kỳ).
Hóa chất sử dụng trong phƣơng pháp điện di gel biến tính DGGE: Acrylamide, Bis-AA, 50x TAE buffer, Formamide, TEMED (tetramethyl ethylenediamine), APS (Ammonium persulfate) do hãng Affymetric (USB, Mỹ) cung cấp.
Hoá chất sử dụng trong các thí nghiệm Sinh học phân tử: Bộ hóa chất sử dụng tách ADN (Glycogen 20 mg/ml, Ethanol 100 %, Ammonium acetate) , phản ứng PCR (USB Taq PCR Master Mix 2x), điện di kiểm tra sản phẩm PCR (HydraGreen Safe ADN Stain 20 000x, Loading Dye 6x, GeneRuler 1kb ADN Ladder), tinh sạch sản phẩm PCR (ExoSAP-IT PCR Product Cleanup). Tất cả đều
Vật liệu cấu tạo pin nhiên liệu vi sinh vật: - Polyacrylic (Việt Nam)
- Vải than chì (Việt Nam) - Thanh than chì (Việt Nam) - Màng nafion 117 (Hoa Kỳ) - Nối nhanh ϕ 4 mm (Trung Quốc) - Ống nƣớc phi ϕ 4 mm (Đài Loan) - Dây chuyền nƣớc (Trung quốc) Đồng Hồ đo điện:
- Đồng hồ vạn năng Extech (Hoa Kỳ)
- Máy đo điện tự động KEITHLEY (Hoa Kỳ)
2.1.2 Nguồn vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành chọn lựa các nguồn quần xã khác nhau phục vụ cho việc làm giàu hệ vi sinh vật điện hóa có khả năng tốt nhất cho việc phát triển cảm biến sinh học trong MFC từ nguồn tự nhiên và nguồn đã bị ô nhiễm gồm:
- Nguồn bùn thải khu dân cư: phố Chùa Láng – quận Đống Đa - Hà Nội
- Mẫu đất tự nhiên (ĐT): gồm hỗn hợp các nguồn đất đƣợc lấy từ Fansipang –
Sapa – Lào Cai, Đất tại vƣờn quốc gia Cúc Phƣơng và đầm Vân Long – Ninh Bình. - Mẫu bùn tự nhiên (BT): gồm hỗn hợp của bùn đƣợc lấy từ Đầm vân Long –
Ninh Bình vàVƣờn quốc gia Xuân Thủy – Nam Định.
- Mẫu bùn hoạt tính (BH): Gồm bùn kỵ khí và hiếu khí (Nhà máy bia Hà Nội
– Hƣng Yên – Khu Công Nghiệp Phố Nối A – Hƣng Yên).
- Mẫu Nước Thải (NT): Bùn và nƣớc thải hỗn hợp (Làng giấy Phong Khê –
Bắc Ninh; Làng tái chế kim loại Đan Hội – Bắc Ninh; Cơ sở dệt nhuộn – Hồi Quan – Bắc Ninh; Làng tái chế Ni lon – Văn Giang – Hƣng Yên).
- Mẫu hỗn hợp (HH): là hỗn hợp của mẫu đất tự nhiên, bùn tự nhiên, bùn hoạt
tính, nƣớc thải đƣợc trộn với nhau.
2.2 CÁC THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Lựa chọn thiết kế tối ƣu cho MFC
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu, tổng hợp, đánh giá các ƣu nhƣợc điểm của các dạng thiết kế MFC- và các vật liệu sử dụng cho MFC đã đƣợc công bố, qua đó chúng tơi tiến hành lựa chọn dạng vật liệu-thiết kế phù hợp nhất cho việc thiết kế MFC có khả năng làm cảm biến sinh học trong điều kiện Việt Nam.
2.2.2 Thiết kế, lắp đặt hệ thống MFC
Pin nhiên liệu vi sinh vật đƣợc thiết kế dựa trên thiết kế của Kim và cộng sự [26]. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thử nghiệm hai dạng thiết kế MFC (dạng khoang hình hộp chữ nhật và khoang hình trụ) và ba thể tích khoang anode (5 ml; 7,5 ml; và 10 ml) .
Cụ thể, với MFC dạng thiết kế khoang hình chữ nhật (Hình 15) đƣợc cấu tạo từ polyarylic gồm: khoang cathode có thể tích là 7,5 ml với kích thƣớc ngồi là 50 x 100 x 15 mm, và kích thƣớc khoang là 50 x 10 x 15mm; khoang anode có thể tích khoang lần lƣợt là 5 ml, 7,5 ml, 10 ml với kích thƣớc ngồi là 50 x 100 x A (A = 10; 15; 20 mm), và kích thƣớc khoang trong bằng 50 mm x 10 mm x H (H = 10; 15 ; 20 mm). MFC đƣợc chặn ngồi bằng hai tấm ốm có kích thƣớc 50 x 100 x 15 mm. Khoảng cách giữa các tấm đƣợc ngăn cách bởi một lớp cao su dày 1 mm, hai khoang anode cà cathode đƣơc ngăn cách bằng màng Nafion N117 (DuPont, Hoa Kỳ), thiết bị đƣợc cố định bằng ốc và bu lông. Điện cực tại khoang anode và cathode đƣợc cấu tạo bằng vải than chì có kích thƣớc 9 mm x 45 mm x 5 mm với điện trở 0, 8 Ω/cm2
đƣợc nối với thanh gom điện bằng than trì có đƣờng kính 6 mm với điện trở 0, 2 Ω/cm2, hai điện cực đƣợc nối với điện trở 10Ω thông qua dây nối
MFC dạng thiết kế khoang hình trụ (Hình 16) đƣợc làm từ polyacrylic gồm: khoang cathode có thể tích là 7,5 ml kích thƣớc 45,24 x 45, 24 x 15 mm, kích thƣớc khoang đƣờng kính 25,24 mm độ cao 15 mm. Khoang anode có thể tích khoang lần lƣợt là 5 ml, 7,5 ml, và 10 ml có kích thƣớc ngồi 45,24 x 45, 24 x A (A = 10; 15; 20 mm), kích thƣớc khoang đƣờng kính 25,24 mm và chiều cao H = 10; 15; 20 mm. Mỗi khoang sẽ đƣợc ngăn bằng tấm chặn ngồi có kích thƣớc 45,24 x 45, 24 x 15 mm. Điện cực tại khoang anode và cathode đƣợc cấu tại bằng vải than chì có kích thƣớc 25 mm x 5mm điện trở 0,8 Ω/ cm2, và đƣợc nối với thanh gom điện bằng than chì có đƣờng kính 6 mm điện trở 0,2 Ω/ cm2, khoảng cách giữa các tấm đƣợc ngăn cách bởi một lớp cao su dày 1 mm, hai khoang anode và cathode đƣơc ngăn cách bằng màng Nafion N117 (DuPont, Hoa Kỳ), thiết bị đƣợc cố định bằng ốc và bu lông, đầu thanh gom điện than chì đƣợc nối với dây dẫn (đƣờng kính 1 mm) bằng