2.2 CÁC THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.7 Phƣơng pháp DGGE
Quy trình tách chiết DNA [30]: Mẫu điện cực anode hoặc dịch vi khuẩn đƣợc
tách chiết DNA theo quy trình sau: Các ống Eppendorf có chứa 1 ml mẫu đƣợc ly tâm trên máy Eppendorf 5417R (Đức) ở 8000 rpm, 20oC trong 10 phút. Gạn bỏ dịch nổi; phần lắng đƣợc mix đều với 0,5 mL nƣớc vô trùng MQ. Sau đó, các dung dịch này đƣợc bổ sung 500 µL hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25: 24: 1) và vortex khoảng 20 giây trƣớc khi ly tâm trên máy Eppendorf 5417R (Đức) ở 14.000 rpm, 20°C trong 10 - 15 phút. Tiếp đến, thu dịch nổi và chuyển vào một ống
Eppendorf vô trùng khác. Các ống này tiếp tục đƣợc bổ sung lần lƣợt 1 µL glycogen, 100 µL 7,5 M ammonium acetate và 750 µL ethanol 100% trƣớc khi ủ qua đêm ở nhiệt độ -20 °C. Hỗn hợp này tiếp tục đƣợc ly tâm trên máy Eppendorf 5417R (Đức) với điều kiện 14.000 rpm, 30 phút, 4 °C thu DNA, DNA thu đƣợc đƣợc rửa lại ba lần trong dung dịch ethanol 70%. Cuối cùng, DNA đƣợc để khô tự nhiên qua đêm trƣớc khi pha lỗng với 50 µL nƣớc PCR. Sản phẩm tách chiết DNA đƣợc kiểm tra trên máy điện di BioRad (Mỹ) với nồng độ gel agarose 1% có chứa thuốc nhuộm HydraGreen Safe ADN Stain 20 000x (ACTGene) trong dung dịch TAE 1x với hiệu điện thế 100 V-thời gian 20 phút, và đƣợc quan sát trên máy soi gel LMW-20 UVP (UK).
Bảng 13: Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân gen16s rRNA
Thành phần phản ứng Thể tích Chu trình nhiệt Taq PCR mix 12,5 µL 1. 95oC: 5 min 2. 95oC: 1 min 53oC: 45 s 72oC: 1 min Lặp lại 30 chu kì. 3. 72oC: 7 min P63F (10 µM) 1,5 µL P1378R (10 µM) 1,5 µL DNA khuôn 1,5 µL Nƣớc PCR 8 µL Tổng thể tích 25 µL
Quy trình khuếch đại đoạn gen 16s rRNA: DNA thu đƣợc từ điện cực anode
hoặc chủng nuôi cấy thuần sẽ đƣợc đƣa vào chạy PCR trên máy PCR 9700 (Applied Biosystems, Mỹ) với mục đích khuếch đại gen 16s rRNA (1400 bp) bằng cặp mồi p63F (5′CAGGCCTAACACATGCAAGTC3′, mồi xuôi) và p1378R (5’CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG3’, mồi ngƣợc) [19] với thành phần
BioRad (Mỹ) với nồng độ gel agarose 1% có chứa thuốc nhuộm HydraGreen Safe ADN Stain 20 000x (ACTGene) trong dung dịch TAE 1x với hiệu điện thế 100 V- thời gian 20 phút, và đƣợc quan sát trên máy soi gel LMW-20 UVP (UK). Sau khi nhân đoạn 16s rRNA của mẫu thành công, chúng tôi tiếp tục sử dụng sản phẩm PCR khuếch đại gen 16s rRNA làm khuôn nhằm khuếch đại vùng V3 (200 bp) bằng cặp mồi p338F-GC (với một kẹp GC đƣợc thêm vào) (5’ ACTCCTACGGGAGGCAGCAG 3’, mồi xuôi) và p518R (5’ATTACCGCGGCTGCTGG 3’, mồi ngƣợc) [47] theo quy trình ở Bảng 14 để phục vụ cho q trình phân tích trên DGGE. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra trên máy điện di BioRad (Mỹ) với nồng độ gel agarose 1% có chứa thuốc nhuộm HydraGreen Safe ADN Stain 20 000x (ACTGene) trong dung dịch TAE 1x với hiệu điện thế 100 V-thời gian 20 phút, và đƣợc quan sát trên máy soi gel LMW-20 UVP (UK).
Bảng 14: Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân vùng V3 thuộc gen16s rRNA
Thành phần phản ứng Thể tích Chu trình nhiệt
Taq PCR mix 12,5 μL 1. 95oC: 5 min
2. 95oC: 30 s 53oC: 30 s 72oC: 45 s Lặp lại 30 chu kì. 3. 72oC: 5 min p338F (10 μM) 1,5 μL P518R (10 μM) 1,5 μL DNA khuôn 1,5 μL Nƣớc PCR 8μL Tổng thể tích 25 μL
Bảng 15: Thành phần của dung dịch biến tính 0% và 60%
Thành phần Dung dịch biến tính 0% Dung dịch biến tính 60%
Acrylamide 6 g 4,5 g Bis-AA 0,162 g 0,122 g 50 x TAE 2,5 mL 1,9 mL Urea - 25,2 g Formamide - 24 mL MQ water 100 mL 100 mL
Quy trình điện di DGGE: Quá trình điện di đƣợc tiến hành trên gel
polyacrylamide 6% với gradient biến tính Urea/ formamide từ 45% đến 60% (Bảng 15, 16). Ta tiến hành trộn 15 µl mỗi mẫu với 10 µl Loading Dye 6x và tra vào mỗi giếng. Quá trình điện di đƣợc thực hiện bằng bộ điện di DGGEK – 2401 (C.B.S Scientific - Mỹ), trong đệm TAE 1x, ở nhiệt độ 60oC, hiệu điện thế 38V, thời gian 16 giờ. Sau khi điện di, bản gel đƣợc nhuộm trong dung dịch HydraGreen Safe ADN Stain 1x trong 30 phút, sau đó rửa lại bằng nƣớc cất trong 10 phút và quan sát bằng máy soi LMW-20 UVP (UK).
Bảng 16: Thành phần của “Working solution”
Dung dịch stock Dung dịch biến tính 45% Dung dịch biến tính 60% Dung dịch biến tính 0% Dung dịch 60% 7,5 mL 10 mL 0 mL Dung dịch 0% 2,5 mL - 5 mL TEMED 8 µL 8 µL 5 µL APS 10% 40 µL 40 L 20 L
Quy trình thơi gel: Những băng phân tách trên bản gel DGGE đƣợc cắt bằng
dao cắt gel vơ trùng, sau đó đƣợc rửa lại bằng nƣớc MQ và bổ sung thêm 50 µl nƣớc MQ, để qua đêm ở 4oC. Dịch thôi ADN đƣợc dùng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR tƣơng tự nhƣ phản ứng PCR cho DGGE Bảng 15 với cặp mồi 338F và 518R. Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ kit ExoSAP – IT (Affymetric) và giải trình tự bởi FirstBase (Singapore).
Phân tích kết quả DGGE: Kết quả điện di DGGE sẽ đƣợc phân tích nhờ
phần mềm NTSYSpc2.0 dựa trên phân tích ma trận tƣơng đồng – ma trận khoảng cách của mẫu từ số lƣợng băng thu đƣợc, sau đó tiến hành phân tích nhóm (cluster analyses) để xác định tƣơng quan giữa các quần xã. Trình tự gen 16S rRNA của các đơn chủng và trình tự của các băng thu đƣợc trên điện di DGGE đƣợc phân tích trên phần mềm clustalx 2.0, và BioEdit Sequence Aligment Editor, sau đó đƣợc tiến hành tìm kiếm so sánh trình tự tƣơng đồng trên công cụ BLAST của NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN