từ dạng glucoside sang dạng aglucone nhờ enzyme Sumizyme FP Thời gian (h) Hàm lƣợng isoflavone dạng aglucone (mg/100g)
Daidzein Genistein
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
2 6,11 6,65
4 8,52 8,87
6 8,63 8,96
8 8,98 9,27
Hình 3.2. Hiệu suất chuyển hóa isoflavone trong sữa đậu tƣơng thủy phân bởi enzyme Sumizyme FP theo thời gian
Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy hàm lƣợng của cả 2 isoflavone dạng aglucone là daidzein và genistein đều tăng lên theo tỷ lệ thuận với thời gian thủy phân từ 1 đến 8 h. Tuy nhiên, khi kéo dài thủy phân kéo dài thời gian thủy phân hơn 4h thì sữa đậu tƣơng xảy ra hiện tƣợng đông tụ và phân lớp, một biểu hiện của sữa đậu tƣơng bị hƣ hỏng. Nguyên nhân có thể là do sữa đậu tƣơng rất giàu protein nên với thời gian thuỷ phân dài sẽ ảnh hƣởng đến chất lƣợng của dịch, đặc biệt ở điều kiện thuỷ phân 50oC. Do vậy, chúng tôi lựa chọn thời gian thuỷ phân là 4h. Với thời gian này, hàm lƣợng isoflavone tuy có thấp hơn so với các thời điểm 6 và 8h nhƣng đảm bảo đƣợc chất lƣợng của sản phẩm.
Từ những kết quả trên, có thể kết luận điều kiện thích hợp cho q trình chuyển hoá isoflavon từ dạng glucosid sang dạng aglucone bằng enzyme đã đƣợc xác định là:
49.63 65.78 88.25 89.26 92.61 20 30 40 50 60 70 80 90 100 h iệ u s u ất c h u yể n h óa is ofl avo n (%) 1 2 4 6 8 Thời gian (h)
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
- Chế phẩm enzyme : Sumizyme FP của Shin-nihon Kagaku (Nhật Bản). - pH tối ƣu : 5,0
- Nhiệt độ tối ƣu : 500C - Nồng độ enzyme thích hợp : 1,0 % - Thời gian thuỷ phân : 4 h
Sữa đậu tƣơng thủy phân bởi enzyme Sumizyme FP với các điều kiện tối ƣu đã đƣợc phân tích isoflavone. Dịch sữa đậu tƣơng sau khi thủy phân đƣợc phân tích chất lƣợng và kết quả trình bày trong bảng 3.6. Hàm lƣợng các aglucone của sữa đậu tƣơng sau quá trình thủy phân là 17,67 mg/100g (daidzein và genistein tƣơng ứng là 8,52mg/100g và 8,87mg/100g) với hiệu suất chuyển hóa isoflavone đạt 88,25%.
ng 3.6. Đặc tính của dịch sữa đậu tƣơng thủy phân bằng enzyme Sumizyme FP
STT Chỉ tiêu Đơn vị Sữa đậu tƣơng
Trƣớc thủy phân Sau thủy phân
1 Protein g/100g 4,21 7,84
2 Lipid g/100g 3,73 3,52
3 Nồng độ chất khơ hịa tan o
Bx 8,0 8,0
4 Isoflavone tổng số mg/100g 25,20 20,45
5 Isoflavone glycoside mg/100g 23,64 2,78
6 Isoflavone aglucone mg/100g 1,56 17,67
3.1.3. Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất sữa đậu tương giàu isoflavone dạng aglucone bằng phương pháp thủy phân với enzyme Sumizym FP
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học Quy trình cơng nghệ: Đậu tƣơng Xử lý nguyên liệu - Loại bỏ hạt hỏng - Rửa sạch - Ngâm nƣớc 50oC/4h Tách vỏ Nghiền Lọc Nƣớc Thủy phân - Nhiệt độ: 500C - Thời gian: 4h - pH: 5,0 - Nồng độ enzyme: 1,0%
Sữa đậu tƣơng thủy phân giàu
isoflavone aglucone
Sumizyme FP
Bã
Sữa đậu tƣơng
Đun sôi
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
Hình 3.3. Quy trình cơng nghệ sản xuất sữa đậu tƣơng giàu aglucone bằng phƣơng pháp thủy phân với enzyme Sumizyme FP
Thuyết minh quy trình cơng nghệ
1. Xử lý nguyên liệu:Hạt đậu tƣơng nguyên hạt đƣợc loại bỏ hạt hƣ hỏng, cát sạn
và sau đó rửa 3 lần bằng nƣớc sạch để loại bỏ hết bụi bẩn. Sau đó, ngâm đậu tƣơng trong nƣớc ở nhiệt độ 50oC trong thời gian 4h.
2. Tách vỏ: Đậu tƣơng ngâm xong đƣợc vớt ra để ráo nƣớc và đãi tách vỏ.
3. Nghiền: Đậu tƣơng đã tách vỏ đƣợc nghiền mịn với nƣớc theo tỷ lệ đậu tƣơng:
nƣớc = 1:4.
4. Lọc: Lọc dịch sữa đậu tƣơng thu đƣợc bằng vải lọc để loại bỏ bã. Điều chỉnh
nồng độ chất khơ hịa tan của dịch sữa đậu tƣơng đạt 8o Bx.
5. Thủy phân: Chế phẩm enzyme Sumizyme FP đƣợc bổ sung vào sữa đậu tƣơng
8oBx với nồng độ enzyme 1,0 để bắt đầu quá trình thủy phân. Các điều kiện thủy phân là pH: 5,0; nhiệt độ 50oC và thời gian 4h.
6. Đun sôi: Kết thúc quá trình thủy phân, tiến hành đun sơi sữa đậu tƣơng trong
thời gian 10 phút để bất hoạt hoàn toàn enzyme Sumizyme FP. Sữa đậu tƣơng thủy phân thu đƣợc có hàm lƣợng isoflavone dạng aglucone là 17,67mg/100g (hàm lƣợng các daidzein và genistein tƣơng ứng là 8,52mg/100g và 8,87mg/100g). Hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang dạng aglucone đạt 88,26%.
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
3.2. Nghiên cứu nâng cao hàm lƣợng isoflavone aglucone trong sữa đậu tƣơng bằng phƣơng pháp lên men
Lên men là phƣơng pháp đƣợc sử dụng từ xa xƣa để chế biến các thực phẩm đậu tƣơng. Hàm lƣợng isoflavone trong các sản phẩm đậu tƣơng lên men đƣợc xác định là cao hơn so với các sản phẩm đậu tƣơng không lên men (Wang và Murphy, 1994). Nguyên nhân đƣợc cho là nhờ enzyme -glycosidase của vi sinh vật đã thủy phân các glycosid thành aglucone tƣơng ứng. Đã có nhiều vi sinh vật có khả năng sản sinh enzyme -glucosidase đƣợc lựa chọn để lên sữa men đậu tƣơng nhƣ
Lactobacillus, bifidobacterium,…. nhƣng trong đề tài này, chúng tôi sử dụng chủng vi
khuẩn Bacillus subtilis LH10 phân lập từ sản phẩm natto của vùng Nagoya (Nhật Bản) vì đặc tính khơng tạo ra vị chua cho sữa đậu tƣơng lên men.
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất dịch sữa đậu tương đến sự chuyển hóa isoflavon
Các thí nghiệm đƣợc tiến hành ở các nồng độ cơ chất khác nhau là 4, 6, 8 và 10oBx. Chủng vi khuẩn B.subtilis LH10 đƣợc cấy với nồng độ 1,5%, quá trình lên men đƣợc tiến hành ở nhiệt độ 37o
C, khuấy 150 vòng/phút trong thời gian 36h. Hàm lƣợng glycoside và aglucone trƣớc và sau quá trình lên men đƣợc phân tích và trình bày ở bảng 3.7. Hiệu suất chuyển hóa isoflavone đƣợc minh họa ở hình 3.4.
Bảng 3.7. Hàm lƣợng isoflavone glycoside và isoflavone aglucone trƣớc và sau lên men của các mẫu có nồng độ cơ chất ban đầu khác nhau
Nồng độ cơ chất (o
Bx)
Trƣớc lên men (mg/100g)
Sau lên men (mg/100 g)
Glycoside Aglucone Glycoside Aglucone
4 11,94 0,67 5,81 4,48
6 17,38 1,14 6,95 7,66
8 23,64 1,56 8,11 11,19
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
Hình 3.4. Hiệu suất chuyển hóa glycoside sang aglucone ở các nồng độ cơ chất lên men ban đầu khác nhau
Kết quả ở bảng 3.6 cho thấy hàm lƣợng aglucone tăng lên đáng kể ở tất cả các mẫu lên men có nồng độ cơ chất khác nhau, cụ thể là aglucone tăng từ 0,67mg/100g lên 4,48mg/100g (nồng độ 4oBx), từ 1,14mg/100g lên 7,66mg/100g (nồng độ 6oBx), từ 1,56mg/100g lên 11,19mg/100g (nồng độ 8oBx) và từ 1,79mg/100g lên 7,40mg/100g (nồng độ 10oBx). Ngƣợc lại với sự tăng lên của aglucone, hàm lƣợng glycoside giảm ở tất cả các mẫu với mức độ khác nhau, có nghĩa là hiệu suất chuyển hóa isoflavone là khơng giống nhau ở các nồng độ cơ chất ban đầu thay đổi từ 4 đến 10o
Bx. Hình 3.4 cho thấy ở nồng độ cơ chất ban đầu là 4, 6 và 8% thì tỷ lệ chuyển hóa tƣơng ứng là 51,4%; 60,1% và 65,7%. Điều đáng lƣu ý là ở nồng độ cơ chất ban đầu 10%, hiệu suất chuyển hóa của cả daidzin và genistin đều rất thấp, chỉ đạt 32,5%, mặc dù số lƣợng tế bào trong q trình lên men khơng có sự khác biệt nhiều so với các mẫu có nồng độ cơ chất ban đầu là 4,6, 8 và 100Bx (bảng 3.8). Từ những kết quả trên, lựa chọn nồng độ cơ chất 80Bx cho những nghiên cứu tiếp theo.
51.34 60.01 65.69 32.5 20 30 40 50 60 70 80 90 100 4 6 8 10 Nồng độ cơ chất (oBx) H iệ u su ất ch uy ển h óa (%)
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
Bảng 3.8. Số lƣợng tế bào trong quá trình lên men ở các nồng độ cơ chất khác nhau bởi vi khuẩn B.subtilis LH10
Nồng độ cơ chất (o
Bx) Số lƣợng tế bào sau lên men 12h (tế bào/ml)
4 16,0 x 108
6 15,2 x 108
8 16,4 x 108
10 15,5 x 108
3.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống vi khuẩn đến khả năng chuyển hóa isoflavone
Giống vi sinh vật cấy vào môi trƣờng sữa đậu tƣơng có vai trị khởi động q trình lên men. Do vậy, tỷ lệ giống vi sinh vật khởi động có ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu suất chuyển hóa isoflavone. Trong phần nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành cấy các tỷ lệ giống khác nhau là 0,5%; 1%; 1,5% và 2,0% vào cơ chất sữa đậu tƣơng 8o
Bx đã đƣợc thanh trùng. Quá trình lên men diễn ra ở điều kiện nhiệt độ 37oC trong thời gian 24 h. Sau khi lên men, xác định hàm lƣợng glycoside và aglucone trong dịch lên men bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp, kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.4.
Hình 3.5. Hàm lƣợng isoflavone glucoside và isoflavone aglucone sau khi lên men với các tỷ lệ giống khác nhau
12.85 7.94 7.07 9.26 7.2 11.31 11.45 10.5 2 4 6 8 10 12 14 16 0.5 1.0 1.5 2.0 Tỷ lệ giống (%) H àm l ƣ ợ n g is of lavo n ( m g/ 100 g) Glycoside Aglucone
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
Căn cứ vào kết quả minh họa ở hình 3.5 cho thấy rõ ràng là trong các mẫu lên men với tỷ lệ giống khác nhau, hàm lƣợng isoflavon dạng aglucone thấp nhất ở mẫu cấy giống 0,5% (7,20mg/100g). Khi tăng tỷ lệ giống cấy lên 1%, hàm lƣợng aglucone tăng lên 11,31mg/100g. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng tỷ lệ cấy giống lên 1,5% thì hàm lƣợng aglucone khơng tăng lên lên nhiều (11,45mg/100g) và khi tăng tỷ lệ tiếp giống lên 2% thì hàm lƣợng aglucone khơng những khơng tăng lên mà còn giảm đi, xuống còn 10,50mg/100g. Điều này chứng tỏ rằng tỷ lệ cấy giống thấp hoặc cao hơn giá trị 1,0-1,5% đều ảnh hƣởng không tốt đến khả năng chuyển hóa glycoside sang aglucone của vi khuẩn Bacillus subtilis LH10 trong quá trình lên men dịch sữa đậu tƣơng.
3.2.3. Ảnh hưởng của pH dịch lên men đến khả năng chuyển hóa isoflavone
Kết quả minh họa trong hình 3.6 cho thấy khả năng chuyển hóa isoflavone từ glycoside sang aglycone của vi khuẩn B.subtilis LH10 đạt hiệu quả cao trong khoảng
pH dịch lên men ban đầu từ 6,0-7,0, tuy nhiên, hàm lƣợng aglucone đạt đƣợc cao nhất tại pH 6,5, là 11,92mg/100g. Tại giá trị pH bằng 7,0, mặc dù số lƣợng tế bào đạt đƣợc cao nhất (18,5 x 108
CFU/ml) nhƣng hàm lƣợng isoflavone aglucone lại thấp hơn so với hàm lƣợng aglucone tại pH bằng 6,5 (chỉ đạt 10,73mg/100g). Điều này có thể đƣợc giải thích là pH 7,0 là tối ƣu cho sự phát triển của sinh khối vi khuẩn nhƣng pH 6,5 lại là tối ƣu cho hoạt động của enzyme β-glucosidase do vi khuẩn sinh ra. Do vậy, tại pH bằng 6,5, khả năng chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang dạng aglycone là cao nhất, dẫn đến hàm lƣợng aglucone tạo thành là lớn nhất.
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
Ghi chú: * giá trị pH của mẫu đối chứng, khơng điều chỉnh pH
Hình 3.6. Hàm lƣợng isoflavone glycoside, aglucone và số lƣợng tế bào sau khi lên men ở các giá trị pH ban đầu khác nhau
3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chuyển hóa isoflavone
Nhiệt độ có ảnh hƣởng rất quan trọng đến sự phát triển sinh khối và lên men của vi khuẩn B.subtilis. Khảo sát khả năng lên men chuyển hóa isoflavone từ dạng
glycoside sang aglycone ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau từ 37oC đến 45o
C, kết quả phân tích hàm lƣợng isoflavone trong sữa đậu tƣơng lên men sử dụng phƣơng pháp HPLC đƣợc trình bày ở hình 3.7. 0 2 4 6 8 10 12 14 6.0* 6.5 7.0 7.5 8.0 pH dịch lên men H àm lƣợ ng is ofl av on e (m g /1 0 0 g ) 9.10 9.15 9.20 9.25 9.30 Lo g (tế b ào /m l)
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
Hình 3.7. Hàm lƣợng isoflavone dạng glycoside và dạng aglucone của dịch sau khi lên men ở điều kiện nhiệt độ khác nhau
Hình 3.7 cho thấy yếu tố nhiệt độ có ảnh hƣởng rất quan trọng đến hàm lƣợng aglucone tạo thành trong quá trình lên men. Nhiệt độ 40 - 42oC cho kết quả lên men rất tốt, với hàm lƣợng aglucone trong dịch sau lên men là 12,16 mg/100g và 12,47mg/100g tƣơng ứng. Theo Chiou và cộng sự (2010) thì nhiệt độ 450C mới là nhiệt độ thích hợp đối với sự hoạt động của enzym -glucosidase tinh sạch từ đậu tƣơng 16. Tuy nhiên, nhiệt độ lên men 45o
C có thể khơng thích hợp với sự phát triển và lên men của vi khuẩn B.subtilis LH10 nên khả năng chuyển hóa glycoside sang
aglucone rất thấp, hàm lƣợng aglucone chỉ đạt 9,02mg/100g.
3.2.5. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chuyển hóa isoflavone
Theo dõi sự chuyển hóa của isoflavone thơng qua hàm lƣợng aglucone tạo thành và hàm lƣợng glycoside giảm xuống trong suốt quá trình lên men ở các điều kiện đã xác định nhƣ nồng độ cơ chất 8o
Bx, pH bằng 6,5, tỷ lệ tiếp giống 1,0% và nhiệt độ lên men 420
C. Kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.8. 0 2 4 6 8 10 12 14 37 40 42 45
Nhiệt độ lên men (oC)
H àm l ƣ ợ n g i sofl avo n e (mg/ 100 g) Glycoside Aglucone
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
Hình 3.8. Hàm lƣợng isoflavone glycoside và aglucone sau khi lên men ở thời gian khác nhau
Kết quả minh họa trên hình 3.8 cho thấy hàm lƣợng aglucone tăng nhanh trong giai đoạn từ 4-12h của quá trình lên men. Hàm lƣợng aglucone tăng từ 1,49 mg/100g lên 7,15 mg/100g, gấp gần 5 lần. Đây có lẽ là giai đoạn mà hoạt tính enzyme β- glucosidase đƣợc sinh ra nhiều và hoạt động mạnh mẽ nhất. Theo kết quả của Kuo cơng bố năm 2006 thì hoạt tính β-glucosidase của vi khuẩn B.subtilis NTU-18 đƣợc
phát hiện vào thời điểm 8h và đạt đƣợc cao nhất vào 12h của quá trình lên men dịch sữa đậu tƣơng đen 36. Tuy nhiên, sau thời điểm 12h thì hàm lƣợng aglucone tăng chậm hơn và đạt 12,18mg/100g sau 28h lên men. Đặc biệt sau 28h thì hàm lƣợng algucone tăng khơng đáng kể, chỉ tăng 0,13mg/100g ở thời điểm 32h. Theo Katekan (2009), hoạt lực enzyme β-glucosidase giảm xuống 10 lần chỉ sau 3h đạt đƣợc hoạt tính cao nhất 31. Chính vì vậy, chúng tơi cho rằng chỉ nên kéo dài thời gian lên men của vi khuẩn B.subtilis LH10 đến 28 h với hiệu suất chuyển hóa isoflavone đạt 79,95% là phù hợp.
3.2.6. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí vơ trùng đến khả năng chuyển hóa isoflavone
Vi khuẩn Bacillus subtilis là lồi hiếu khí nên oxy là nhu cầu thiết yếu trong
suốt quá trình sinh trƣởng của chúng. Khi lên men sữa đậu tƣơng trong bình tam giác 23.5 21.84 16.9 12.89 12.76 9.03 6.82 4.71 4.52 1.49 1.6 4.94 7.15 8.9 10.21 11.54 12.45 12.58 0 5 10 15 20 25 0 4 8 12 16 20 24 28 32 Thời gian (h) H àm lƣ ợ n g i sof lavo n ( m g/ 100 g) Glycoside Aglucone
Nguyễn Thị Việt Hà Luận văn thạc sỹ khoa học
với thể tích dịch là 0,25 - 0,5 lít/bình, q trình lên men lắc ở tốc độ 150-250 vòng/phút là đủ cung cấp oxi cho hoạt động tạo sinh khối nhƣng khi lên men ở qui mơ 5 lít, hàm lƣợng oxy cung cấp trong q trình khuấy là khơng đủ để vi khuẩn Bacillus subtilis hoạt động trong quá trình lên men. Do vậy, để thực hiện đƣợc quá trình lên
men trên thiết bị lên men 5lít Labo-controller MDL-8C, nhất thiết phải tiến hành xác định hàm lƣợng oxy cung cấp thông qua sục khí vơ trùng. Bảng 3.9 trình bày kết quả lên men sữa đậu tƣơng ở các nồng độ oxi hòa tan khác nhau, thay đổi từ 0,5-2,0 ml/lít/phút (v.v.m) và so sánh với mẫu đối chứng (khơng sục khí vơ trùng trong quá trình lên men).
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của sục khí vơ trùng đến hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ