2.5.1. Giới hạn phát hiện - giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích tạo ra được một tín hiệu mà có thể phân biệt được một cách tin cậy với tín hiệu nền. Có một số cách xác định tuy nhiên đối với các phương pháp sắc kí nói chung và điện di mao quản nói riêng thường sử dụng cách tính:
LOD = 3S/N (2.1)
Trong đó: S/N là tỉ số chiều cao của tín hiệu với chiều cao của nhiễu nền. Giới hạn định lượng là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích tạo ra được một tín hiệu mà phương pháp có thểđịnh lượng được và được xác định bằng công thức:
LOQ = 10S/N (2.2)
2.5.2. Khoảng tuyến tính
Khi đã xác định có mối quan hệ tun tính giữa tín hiệu phân tích và nồng độ chất định phân cần xác định giới hạn tuyến tính (LOL) (bằng cách nới rộng điểm trên của đường chuẩn cho đến khi hệ sốtương quan R đủ lớn hơn 0,99). Khi đó khoảng tuyến tính được định nghĩa là từLOQ đến LOL.
2.5.3. Độ chính xác
Độ chính xác của phương pháp được đánh giá qua hai thông số: độ chụm và độđúng.
Độ chụm đặc trưng cho mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ xi tiến hành trên các mẫu thử giống hệt nhau, được tiến hành bằng một phương pháp phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm hoặc trong các điều kiện thí nghiệm khác nhau.
Độđúng là độ gần nhau giữa các kết quảxác định được (giá trị trung bình) và giá trị thực µ của nó. Để xác định độđúng của phép đo hay của một phép phân tích phải sử dụng mẫu chuẩn hoặc vật liệu so sánh (CRM) được cung cấp bởi đơn vị chế tạo thường là một tổ chức quốc tế nổi tiếng như BCR, NIST, LGC... Trong trường hợp không có vật liệu so sánh này, có thể tự chuẩn bị mẫu chuẩn và phái đảm bảo sao cho mẫu chuẩn và mẫu phân tích có thành phần càng giống nhau càng tốt (dùng mẫu thêm chuẩn).
2.5.4. Độ lặp lại
Độ lặp lại, một cách tương đối là độ sai lệch giữa các giá trị riêng lẻ xi và giá trị trung bình trong những điều kiện thí nghiệm giống nhau và khơng giống nhau. Độ lặp lại có thể xác định thơng qua độ lệch chuẩn (S) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Khi độ lệch chuẩn càng lớn thi sai số của phép phân tích càng lớn.
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát các điều kiện tối ưu các cation
3.1.1. Khảo sát các điều kiện tối ưu phân tích đồng thời các cation: NH4+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Ba2+ bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ K+, Mg2+, Ca2+, Ba2+ bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE-C4D) trên hệ điện di bằng tay
3.1.1.1. Khảo sát lựa chọn pha động điện di
Trong điện di mao quản, dung dịch pha động điện di có vai trị quan trọng trong q trình phân tách các chất phân tích. Với các pha động điện di khác nhau thì sựtương tác giữa pha động điện di và các chất phân tích sẽ khác nhau, vì vậy mà sự phân tách pic trong q trình điện di sẽ khác nhau. Hay nói cách khác sự phân tách pic phụ thuộc vào bản chất pha động điện di. Trong nghiên cứu này, bốn pha động điện di được khảo sát đó là:
• Hệ đệm His/Ace pH 4,0, độ dẫn EC = 750 μS/cm: Histidine được pha ở nồng độ12mM sau đó được thêm axit axetic cho đến pH 4,0. Sau đó thêm 18-crown- 6 để tách hai pic NH4+ và K+[21].
• Hệ đệm Mops/His pH 6,5; độ dẫn EC = 130 μS/cm: Mops và Histidine được cân và pha đều ở nồng độ 10mM. CTAB được thêm vào để điều chỉnh dịng EOF. Sau đó thêm 18-crown-6 để tách hai pic NH4+ và K+.
• Hệđệm Mes/His pH 5,8; độ dẫn EC = 207 μS/cm: Mes và Histidine được cân và pha đều ở nồng độ 10mM. CTAB được thêm vào để điều chỉnh dịng EOF. Sau đó thêm 18-crown-6 để tách hai pic NH4+ và K+.
• Hệđệm Tris/Mops pH 7,7; độ dẫn EC = 1571μS/cm: Tris và Mops được pha ở cùng nồng độ50mM. CTAB được thêm vào đểđiều chỉnh dịng EOF. Sau đó thêm 18-crown-6 để tách hai pic NH4+ và K+.
Điều kiện phân tích: Các điều kiện phân tích là: bơm mẫu thủy động học kiểu xiphong với chiều cao: 10cm trong thời gian: 30s, thế tách: -15kV, mao quản silica nóng chảy đường kính trong: 50µm với chiều dài: 50cm, chiều dài hiệu dụng: 43cm
Hình 8 đưa ra giản đồ điện khi phân tích các cation NH4+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Ba2+ ở pH khác nhau. Nồng độ của các cation NH4+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Ba2+. Ở khoảng pH 5-6 sử dụng đệm MES/His và MOPS/His, hình ảnh các tín hiệu chồng chập lên nhau. Trong điều kiện phân tích, chỉ có hai hệ đệm His/Ace và Tris/Mops có khảnăng phân tách tốt cả 6 cation. Tuy nhiên, hệđệm His/Ace cho hình ảnh tín hiệu pic sắc nét và chiều cao pic lớn hơn so với đệm Tris/Mops, điều này có thể lý giải do độ dẫn của đệm His/Ace nhỏhơn nhiều so với đệm Tris/Mops mà chiều cao pic ảnh hưởng đến giới hạn phát hiện. Do đó, đệm His/Ace được dùng để tiếp tục đánh giá.
Hình 8. Giản đồđiện khi phân tách các anion NH4+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Ba2+ sử dụng các hệđệm khác nhau
3.1.1.2. Khảo sát lựa chọn sát lựa chọn nồng độ 18-crown-6
Hai cation NH4+ và K+ có bán kính ion bằng nhau dẫn tới tỉ số z/m bằng nhau. Vì vậy hai cation này di chuyển với tốc độ như nhau nên khơng tách ra khỏi nhau. Một khó khăn trong việc tách hai cation này là cảhai cation đều khơng có khảnăng tạo phức cho nhận do khơng chứa các obitan d trống. Do vậy đối với các phối tử tạo phức thơng thường ít có khả năng tách hai cation này. Nhiều tác giả đã chỉ ra rằng việc sử dụng một số ete vịng có khảnăng tạo phức với các cation kim loại làm cho kích thước của các ion phức khác nhau [12, 14, 20, 23]. Do đó, trong q trình điện di chúng sẽ tách ra khỏi nhau. Trong nghiên cứu này, 18-crown-6 được lựa chọn làm phối tử tạo phức để tách cation K+ [8, 20]. Nồng độ 18-crown-6 có ảnh hưởng tới sự hình thành phức, do đó nồng độ 18-crown-6 trong pha động điện di là yếu tố tiếp theo cần được khảo sát.
Trong khảo sát này, dung dịch đệm Histidine 12mM, giữ ổn định pH = 4,0 bằng axit axetic và thay đổi nồng độ 18 crown 6 trong dung dịch pha động điện di từ 0,0mM ÷ 3,0mM
Các điều kiện phân tích là: bơm mẫu thủy động học kiểu xiphong với chiều cao: 10cm trong thời gian: 30s, thế tách: -15kV, mao quản silica nóng chảy đường kính trong: 50µm với chiều dài: 70cm, chiều dài hiệu dụng: 63cm.
Hình 9. Giản đồ điện di khi phân tách các cation NH4+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Ba2+ nồng độ 100µM sử dụng đệm His/ace có nồng độ 18-crown-6 khác nhau.
Từ giản đồ điện di của các cation cho thấy, ở nồng độđệm 0mM 18-crown-6 chỉ thu được năm pic, trong đó hai pic của NH4+ và K+ chồng chập vào nhau. Khi thêm 18-crown-6 vào dung dịch đệm, quá trình điện di đã tách ra được sáu pic và độ dẫn của các pic cao hơn độ dẫn của nền. Chứng tỏđã có sự liên kết giữa 18 crown 6 với một số cation dẫn đến sự hình thành phức và các phức này phải tồn tại ở dạng cation, do đólàm tăng mức độ cồng kềnh của cation phức dẫn đến thời gian xuất hiện các pic này chậm hơn so với khi chưa thêm 18 crown 6. Khi tăng nồng độ của 18- crown-6 thời gian lưu của hai pic K+ và Ba2+tăng, chứng tỏ nồng độ18 crown 6 tăng, độ cồng kềnh của các cation phức tăng và cation Ba2+ tạo phức với 18 crown 6 tốt hơn K+ [8].
Để tăng giới hạn phát hiện của phương pháp cần lựa chọn hệ đệm cho diện tích pic lớn nhất. Diện tích pic của các ion ở các nồng độ 18-crown-6 khác nhau được chỉ ra ở hình 13.
Hình 10. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ 18-crown-6
Hình 10 cho thấy, ở nồng độ 2mM và 3mM 18-crown-6, diện tích pic của các cation là lớn nhất. Tuy nhiên, dung dich đệm chứa 2mM 18-crown-6 cho tín hiệu diện tích pic NH4+ lớn, mà NH4+ là một tiêu chí quan trọng để đánh giá chất lượng nước. Vì vậy, đệm His với 2mM 18-crown-6 được lựa chọn để khảo sát những điều kiện tiếp theo.
3.1.1.3. Khảo sát lựa chọn nồng độ pha động điện di
Nồng độ của các thành phần trong pha động điện di có ảnh hưởng đến bề dày của lớp điện tích kép trên bề mặt mao quản silica và độ dẫn của dung dịch. Vì vậy khi thay đổi nồng độ của các thành phần này thì độ lớn của dịng EOF thay đổi làm ảnh hưởng đến sự phân tách các chất trong quá trình điện di.
Trong khảo sát này, dung dịch đệm Histidine được pha với các nồng độ như trong bảng 3, pH được giữổn định ở 4,0 bằng axit axetic, 18 crown 6 2mM.
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Diện tích pic 0,5 mM 1,0mM 1,5mM 2,0mM 2,5mM 3,0mM
Bảng 3. Nồng độ các dung dịch đệm khảo sát Ký hiệu Nồng độ His Độ dẫn (μS/cm) Ký hiệu Nồng độ His Độ dẫn (μS/cm) His 3mM 3mM 268 His 6mM 6mM 413 His 9mM 9mM 580 His 12mM 12mM 750 His 15mM 15mM 902 His 18mM 18mM 1020
Các điều kiện phân tích: bơm mẫu thủy động học kiểu xiphong với chiều cao: 10cm trong thời gian: 30s, thế tách: -15kV, mao quản silica nóng chảy đường kính trong: 50µm với chiều dài: 70cm, chiều dài hiệu dụng: 63cm, nồng độ các cation: NH4+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Ba2+đều bằng 100µM.
Hình 11. Giản đồđiện phân tách đồng thời các cation cơ bản ở các nồng độđệm khác nhau
Khi nồng độHis tăng thì cation Na+có xu hướng di chuyển nhanh hơn. Điều này có thểđược giả thuyết rằng: khi nồng độ His tăng, độ dẫn điện tăng, tương tác giữa các cation với pha động điện di có sựthay đổi trong đó tương tác của Na+tăng mạnh dẫn tới tốc độ di chuyển của Na+tăng lên.
Từ giản đồđiện di ở hình 11 cho thấy: các pic Ca2+, Na+, Mg2+ kém phân tách nhất, tại các đệm có nồng độ His bằng 3mM và 6mM, hai pic Na+ và Mg2+ bị chồng chân pic. Đối với các đệm có nồng độ His từ9mM đến 18mM, các pic tách tốt. Do đó, độ phân giải giữa các pic là tiêu chí lựa chọn nồng độ đệm His tối ưu cho quá trình tách.
Độ phân giải giữa các pic trong các điều kiện nồng độđệm khác nhau được chỉ ra ở hình sau:
Hình 12. Độ phân giải giữa các pic phụ thuộc vào nồng độđệm
Từ các dữ kiện trên, độ phân giải R giữa các pic đều thỏa mãn điều kiện R ≥ 1,5. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ His thì giá trị R đối với hai pic Ca2+ và Na+ giảm, trong khi R của hai pic Na+ và Mg2+tăng dần. Do đó, hệđệm His 12mM được chọn là điều kiện tối ưu cho quá trình tách vì R giữa các pic đều đạt giá trị lớn.
Từ những kết quảtrên, đệm His 12mM được lựa chọn để tiếp tục tối ưu trong các bước tiếp theo.
3.1.2. Khảo sát các điều kiện tối ưu phân tích đồng thời các cation: NH4+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Ba2+ trên hệ SIA-CE-C4D K+, Mg2+, Ca2+, Ba2+ trên hệ SIA-CE-C4D
Hệ SIA-CE là hệ thiết bị điện di phân tích một cách tựđộng tuần tự, các thao tác thực hiện nối tiếp nhau, hết thao tác này mới bắt đầu chuyển sang thao tác khác.Q trình phân tích chung của hệ SIA-CE có thể minh họa bằng sơ đồsau đây:
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 H i s 9 . 0 m M H i s 1 2 . 0 m M H i s 1 5 . 0 m M H i s 1 8 . 0 m M Độ phân giải Nồng độ đệm
Hình 13. Sơ đồ biểu diễn các bước phân tích trên hệ SIA-CE-C4D
Quá trình nạp mẫu vào mao quản được thể hiện qua sơ đồsau đây:
Hình 14. Sơ đồ biểu diễn quá trình đẩy mẫu vào mao quản
Xylanh 5000µL Dung dịch đệm Thải Van 1 Van 2 Thải Van kim Mao quản Interface nối đất Interface Công tắc điện
Trong quá trình nạp mẫu vào mao quan: mẫu được đẩy đi qua van đa cổng tới interface nối đất, lúc này van 1 đóng và van 2 mở. Thơng qua vị tri của van kim, van 2 được điều chỉnh chỉ mở một phần nhằm tạo áp suất ngược đẩy mẫu vào mao quản. Lượng mẫu đi vào mao quản, ngoài thểtích bơm mẫu, cịn phụ thuộc vào độ lớn của áp suất ngược hay nói cách khác phụ thuộc vào vị trí của van kim.
3.1.2.1. Khảo sát lựa chọn thể tích bơm mẫu
Khi áp suất ngược khơng đổi, lượng mẫu vào mao quản tỉ lệ với thểtích bơm mẫu (VS). Lượng mẫu vào mao quản lớn làm tăng diện tích pic tuy nhiên độ phân giải giảm. Ngược lại, lượng mẫu nạp vào nhỏ, độ nhạy của phương pháp giảm, đơi khi do q trình khuếch tán làm giảm độ lặp lại. Do đó cần thiết phải tối ưu giá trị VS nhằm đạt được hiệu quả tốt nhất trong q trình phân tích.
Trong khảo sát này, chúng tôi giữ cố định các điều kiện đã tối ưu, SP 15, VP 16 và thay đổi thểtích bơm mẫu từ 50, 100, 150, 200, 250 µL. Kết quả chỉ ra ở hình 15.
Hình 15. Giản đồđiện di khảo sát sựảnh hưởng của thểtích bơm mẫu đến sự
phân tách các pic; pha động điện di: histidine 12mM, 18-crown-6 2mM thêm
axit axetic đến pH 4,0; tốc độđẩy mẫu: SP 15; vị trí van chia dịng: 16/50 vịng thứ nhất; điện thế tách: -15kV.
Hình 16. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic vào thểtích bơm mẫu
Hình 17. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ phân giải giữa các pic vào thể tích
bơm mẫu
Từ các hình trên cho thấy thể tích mẫu bơm tỉ lệ thuận với diện tích pic và tỉ lệ nghịch với độ phân giải R. Điều này chứng tỏ khi tăng thểtích bơm, lượng mẫu nạp vào mao quản tăng dần đồng thời gây ra một áp suất dư lớn trong lòng mao quản
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600
NH4+ K+ Ca2+ Na+ Mg2+ Ba2+
D iệ n tíc h pic 50 µL 100 µL 150 µL 200 µL 250 µL 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 50 µL 100 µL 150 µL 200 µL 250 µL Đ ộ ph ân gi ải R Thể tích bơm mẫu
đẩy mẫu đi theo hình parabol gây ra hiện tượng giãn chân pic, vì vậy mà giá trị độ phân giải giảm dần.
Kết quả cho thấy VS = 150 ữ250àL thu c R 1,3 khụng ỏp ứng được quá trình phân tích do nồng độ các chất phân tích lớn thường khoảng vài trăm µM. Đối với VS = 50µL thu được R rất tốt nhưng diện tích pic kém hơn so với VS = 100µL do đó làm giảm độ nhạy của phương pháp. Mặt khác với thểtích bơm mẫu nhỏ thì chịu ảnh hưởng mạnh của sự khuếch tán vì vậy ở thể tích bơm mẫu này độ lặp lại giảm mạnh. Vì vậy, trong nghiên cứu này, VS = 100µL được chọn là điều kiện tối ưu để khảo sát các điều kiện tiếp theo.
3.1.2.2. Khảo sát lựa chọn tốc độ đẩy mẫu
Như đã nói ởtrên, độ lớn của tốc độđẩy mẫu có ảnh hưởng đến lượng mẫu đi vào mao quản. Đối với bơm Tecan được sử dụng trong hệ SIA-CE-C4D, độ lớn được