Đối với phân tích khả năng sản xuất cytokine tiền viêm và kháng viêm bằng zymosan trong BMDM bằng kít ELISA, ở đây là TNF-α, IL-6, IL12p40, IL-10. BMDMs đƣợc tách ra từ chuột đƣợc ủ cùng với LPS hoặc zymosan sau một số thời gian nhất định. Thu dịch sau khi ly tâm các mẫu tế bào. Sau đó các dịch này sẽ đƣợc đo nồng độ TNF-α, IL-6, IL12p40, IL-10 bằng kít ELISA (BD bioscience). Các thủ tục tiến hành đo cytokine sẽ đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của nhà chế tạo kít ELISA. Nồng độ cytokine tiết ra từ các tế bào nuôi cấy sẽ đƣợc đánh giá thông qua khả năng hấp thụ ở bƣớc sóng 540 nm bằng máy ELISA.
Đối với đánh giá hoạt động kích thích viêm của Dectin-1 bằng zymosan, BMDMs đƣợc tiền sử lý cùng với Wedelolactone trong 1 giờ. Sau đó, các tế bào sẽ sử lý cùng với zymosan sau 18 giờ. Dịch các mẫu tế bào này đƣợc thu lại và ly tâm. Sau đó tiến hành đo nồng độ các cytokine giống nhƣ trên.
Đối với đánh giá ức chế hoạt động của Dectin-1, BMDMs đƣợc tiền sử lý cùng với laminarin (một chất có khả năng ức chế hoạt động của Dectin-1) hoặc với galactan (đối chứng với laminarin) trong 1 giờ. Sau đó, các mẫu tế bào này tiếp tục đƣợc ủ cùng với Wedelolactone. Sau 1 giờ, các mẫu tế bào này sẽ đƣợc sử lý cùng
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
với zymosan. Dịch tế bào các mẫu thu đƣợc đem ly tâm và đánh giá nồng độ cytokine giống nhƣ trên.
2.2.4. Phân tích ức chế của Wedelolactone trong quá trình tạo phản ứng oxy hóa
BMDMs đƣợc sử lý cùng với Laminarin hoặc galactan trong 60 phút, và tích lũy với zymosan sau khi đã đƣợc ủ với không hoặc cùng với Wedelolactone trong 60 phút. Sau đó, các tế bào đƣợc ủ với chất huỳnh quang (DHE) trong 15 phút ở 37◦C trong 5% CO2. Những tế bào này sẽ đƣợc kiểm tra bằng laser-scanning confocal microscopy (LSM 510) để xác định mật độ khác nhau của ROS trong các mẫu đã đƣợc xử lý.
Q trình phospho hóa của p47phox. BMDMs đƣợc xử lý nhƣ phần đánh giá khả năng của Wedelolactone đối với MAPKs, ở đây chỉ thay kháng thể thứ nhất bằng p47 và ser345.
2.2.5. Gây nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng ở chuột bằng tiêm zymosan zymosan
Chuột có độ tuổi từ 8-10 tuần (khoảng 18-22 gram) sẽ đƣợc thực hiện gây nhiễm trùng nặng và choáng khuẩn. Chuột sẽ đƣợc tiêm zymosan (2mg/g trọng lƣợng cơ thể) đã đƣợc hòa tan trong đệm phosphate-buffered saline (PBS). Khả năng sống của chuột đƣợc đánh giá sau 5 tiếng đối với 40 giờ đầu và sau đó là 10 giờ trong 5 ngày sau khi tiêm zymosan.
2.2.6. Đánh giá hiệu quả sống xót của chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng trong chuột bằng Wedelolactone nhiễm trùng trong chuột bằng Wedelolactone
Chuột có độ tuổi từ 8-10 tuần ( khoảng 18-22 gram) sẽ đƣợc chia thành các nhóm khác nhau (mỗi nhóm 10 con) bao gồm 4 nhóm:
Nhóm 1: chuột đƣợc tiêm DMSO (đối chứng âm)
Nhóm thứ 2: chuột đƣợc tiêm Wedelolactone (10mg/kg trọng lƣợng cơ thể, Wedelolactone đƣợc hòa trong DMSO)
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Nhóm thứ 3: chuột đƣợc tiêm Wedelolactone (20mg/kg trọng lƣợng cơ thể) Nhóm thứ 4: chuột đƣợc tiêm Wedelolactone (30mg/kg trọng lƣợng cơ thể)
Sau đó, chuột đƣợc gây nhiễm trùng nặng và choáng khuẩn bằng tiêm zymosan (2mg/kg trọng lƣợng cơ thể) đã đƣợc hòa tan trong đệm phosphate-buffered saline (PBS). Wedelolactone đƣợc hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO). Chuột sẽ đƣợc đánh giá trong 5 ngày kể từ khi đƣợc xử lý cùng với Wedelolactone. Khả năng sống của chuột đƣợc đánh giá sau 5 tiếng đối với 40 giờ đầu và sau đó là 10 giờ.
2.2.7. Đánh giá hiệu quả ức chế quá trình sinh cytokine trong huyết thanh của Chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng bằng tiêm Wedelolactone Chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng bằng tiêm Wedelolactone
Chuột sau khi đƣợc thực hiện thí nghiệm nhƣ 2.2.8 sẽ đƣợc lấy máu. Sau đó, máu đƣợc ly tâm và lấy phần huyết thanh để tiến hành phân tích TNF-α, IL-6 bằng phƣơng pháp ELISA nhƣ trên.
2.2.8. Đánh giá hiệu quả Wedelolactone và Dexamethason trong điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng bị nhiễm trùng nặng và chống nhiễm trùng
Chuột có độ tuổi từ 8-10 tuần ( khoảng 18-22 gram) sẽ đƣợc chia thành 3 nhóm (mỗi nhóm 10 con):
Nhóm 1: chuột đƣợc tiêm DMSO (đối chứng âm), Nhóm thứ 2: chuột đƣợc tiêm Wedelolactone
Nhóm thứ 3: chuột đƣợc tiêm Dexamethasone (1mg/kg trọng lƣợng cơ thể)
Sau đó, chuột đƣợc gây nhiễm trùng nặng và chống khuẩn theo 2.2.5. Chuột sẽ đƣợc đánh giá trong 5 ngày kể từ khi đƣợc sử lý cùng với zymosan. Khả năng sống của chuột đƣợc đánh giá sau 5 tiếng đối với 40 giờ đầu và sau đó là 10 giờ.
2.2.9.Phân tích thống kê
Đối với phân tích thống kê, các số liệu đƣợc lấy từ các kết quả độc lập, đƣợc thể hiện ý nghĩa bằng ± SD và đƣợc phân tích bằng student’s t-test cùng với điều chỉnh Bonferroni hoặc ANOVA đối với nhiều phép so sánh. Sự khác nhau sẽ đƣợc chỉ ra ý nghĩa bằng P< 0.05.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh 25 50 75 100 Tỷ lệ tế bào sống (%) ĐC 10 20 30 (μg/ml )
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Khả năng sống của tế bào không bị ảnh hƣởng bởi Wedelolactone
Để khẳng định Wedelolactone có gây độc tố đối với tế bào BMDM hay không, BMDM đƣợc chia đều vào các giếng khác nhau trên đĩa nuôi tế bào 96 giếng với mật độ 1x 105. Các BMDM này đƣợc xử lý với Wedelolactone ở các nồng độ khác nhau nhƣ trên hình 8. Sau đó, BMDM đƣợc ủ cùng với 10 μl kit đếm tế bào. Kết quả đƣợc chỉ ra ở trên hình 8, tỉ lệ phần trăm của các BMDMs khơng có sự khác biệt giữa BMDMs đƣợc xử lý với các nồng độ khác nhau của Wedelolactone sau 48 giờ. Kết quả này, cho thấy Wedelolactone khơng có khả năng gây độc với BMDM.