2.3.1. Mơi trường làm giàu có nồng độ đường cao
Thành phần môi trường Glucose 50°Bx (1000 ml): Glucose (49.5 %), Yeast
extract (0.5 %), nƣớc cất.
Chuẩn bị: cân các thành phần, mỗi hóa chất cho vào 1 bình Schott riêng sau đó
khử trùng ở 115°C, 15 phút. Sau khi khử trùng trộn dung dịch hóa chất lại với nhau cho vào mỗi ống Falcon đã khử trùng 30 ml. Bảo quản trong tủ mát.
Tác dụng: làm giàu nấm men đen trong mẫu thu thập đƣợc.
2.3.2. Mơi trường Malt-Glucose 2Bx có axit lactic 1‰
Thành phần (1000 ml): Malt (1 %), glucose (1 %), agar (2 %), acid lactic 90 %
(1ml acid lactic cho 1000 ml môi trƣờng), nƣớc cất.
Chuẩn bị: Cân các thành phần với tỷ lệ nhƣ trên. Cho hỗn hợp vào bình Schott
bổ sung acid lactic 90 % với tỷ lệ 1 ml acid/ 1000 ml môi trƣờng, trộn đều và đổ ra đĩa Petri trong điều kiện vô trùng.
Tác dụng: dùng làm môi trƣờng phân lập với mẫu đã làm giàu bằng mơi trƣờng
có nồng độ đƣờng cao.
2.3.3. Mơi trường Malt-Glucose 2Bx khơng có axit lactic
Thành phần (1000 ml): Malt (1%), glucose (1%), agar (1,5%), nƣớc cất.
Chuẩn bị: cân các thành phần, cho hỗn hợp vào bình Schott rồi hấp khử trùng ở
121°C trong 15 phút sau đó để nguội mơi trƣờng xuống 70- 80C đổ ra đĩa Petri trong điều kiện vô trùng, môi trƣờng này dùng cho tinh sạch chủng giống.
Cân các thành phần, hoà tan agar sau đó dùng pipet hút 4 ml cho vào ống nghiệm nút xoáy, rồi hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút, sấy nhẹ môi trƣờng cho khô và bảo quản trong tủ mát, môi trƣờng này dùng cho bảo quản giống.
2.3.4. Môi trường thử khả năng chuyển hóa các nguồn cacbon khác nhau [18]
Mơi trường kiểm tra (100 ml): Yeast Nitrogen Base (0,67 g), nguồn cacbon (42
loại 0.5 g/ 100 ml, riêng Raffinose là 1 g/ 100 ml), nƣớc cất.
Môi trường đối chứng dương (100 ml): Yeast Nitrogen Base (0,67 g), glucose
(0,5 g), nƣớc cất.
Môi trường đối chứng âm (100 ml): Yeast Nitrogen Base (0,67 g), nƣớc cất. Chuẩn bị: Cân các thành phần, hòa tan trong nƣớc cất, cho vào mỗi ống nghiệm
kích thƣớc 12 cm x 1,1 cm 2 ml, mỗi ống 1 nguồn cacbon khác nhau. Hấp khử trùng ở 0,9 atm trong 10 phút. Riêng nguồn cacbon là methanol và ethanol đƣợc cho vào sau khi hấp thanh trùng. Bảo quản ở tủ mát.
Tác dụng: thử khả năng chuyển hóa các nguồn cacbon khác nhau.
2.3.5. Mơi trường thử khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau [18]
Thành phần (100ml): Yeast Carbon Base (1,17 g), agar tinh khiết (1 g), nƣớc
Chuẩn bị: cân các thành phần, cho vào bình Schott, hấp khử trùng ở 0,9atm.
trong 10 phút. Để nguội khoảng 40°C rồi đổ ra đĩa Petri sạch trong điều kiện vơ trùng.
Tác dụng: thử khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau.
2.3.6. Thử khả năng sinh trưởng trên mơi trường có nồng độ đường và muối cao
Mơi trường có nồng độ đường cao [18]
Môi trƣờng 50% glucose (1000 ml): Glucose (50%), yeast extract (1%), agar (2%), nƣớc cất
Môi trƣờng 60% glucose (1000 ml): Glucose (60%), yeast extract (1%), agar (2%), nƣớc cất.
Môi trƣờng đối chứng (1000 ml): Glucose (5 %), yeast extract (1%), agar (2%), nƣớc cất.
Chuẩn bị: Cân các thành phần, cho vào bình schott. Hấp khử trùngở 0,9 atm, 110°C trong 10 phút. Để nguội khoảng 70°C đổ ra đĩa petri vô trùng trong điều kiện vô trùng. Đĩa petri đƣợc bảo quản mát.
Tác dụng: Thử khả năng sinh trƣởng trên mơi trƣờng có nồng độ đƣờng cao.
Mơi trường có nồng độ muối cao (10% Nacl) [18]
Thành phần (100 ml): Yeast Nitrogen Base (0,67 g), glucose (5 g), NaCl (10 g), nƣớc cất.
Chuẩn bị: Cân các thành phần, hòa tan trong nƣớc, cho vào mỗi ống nghiệm có nút cao su 2 ml mơi trƣờng, hấp khử trùng ở 120°C, 15 phút. Môi trƣờng sau khi khử trùng đƣợc bảo quản mát.
Tác dụng: thử khả năng sinh trƣởng của nấm men trong mơi trƣờng có nồng độ muối cao.
2.3.7. Mơi trường xác định khả năng sinh trưởng trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau [18] khác nhau [18]
Thành phần (1000 ml): Glucose (4 %), peptone (0,5 %), agar (2 %), nƣớc cất. Chuẩn bị: Cân các thành phần, cho vào bình Schott. Hấp khử trùngở 121°C, 15
phút. Để nguội khoảng 70°C đổ ra đĩa Petri vô trùng trong điều kiện vô trùng. Đĩa Petri đƣợc bảo quản mát.
Tác dụng: Đánh giá khả năng sinh trƣởng của nấm men ở nhiệt độ khác nhau.
2.3.8. Mơi trường thử khả năng hình thành tinh bột [18]
Thành phần (1000 ml): (NH4)2SO4 (2 g), KH2PO4 (2 g), MgSO4.7H2O (1 g), glucose (20 g), agar (20 g), nƣớc cất; pH 4,5
Chuẩn bị: Cân các thành phần, cho và bình Schott hấp khử trùngở 121°C , 15
phút, Để nguội khoảng 70°C đổ ra đĩa Petri vô trùng đã cho sẵn 1 giọt hỗn hợp vitamin trong điều kiện vô trùng. Đĩa Petri đƣợc bảo quản mát.
Dung dich lugol để kiểm tra có thành phần (100 ml): I2 (5 g), KI (10 g), nƣớc cất. Pha loãng dung dịch 5 lần trƣớc khi sử dụng
Tác dụng: Kiểm tra sự hình thành tinh bột trên môi trƣờng nuôi cấy nấm men.
2.3.9. Môi trường đánh giá hoạt tính phân giải urea [18]
Thành phần môi trường Christensen (1000 ml): Pepton (1 g), NaCl (5 g),
KH2PO4 (2 g), glucose (5 g), agar (20 g), nƣớc cất.
Chuẩn bị: cân các thành phần, đun tan môi trƣờng, thêm 6 ml dung dịch đỏ
phenol có nồng độ 0,2 % trong cồn, hấp khử trùng ở 121°C, 15 phút. Để nguội mơi trƣờng tới 50°C thêm 500 µl dung dịch urea (dung dịch 20 % khử trùng riêng qua màng lọc) trộn đều. Sau đó đổ ra đĩa Petri vô trùng trong điều kiện vô trùng. Đĩa Petri đƣợc bảo quản mát.
2.3.10. Môi trường đánh giá khả năng sinh trưởng khi có mặt Cycloheximide
[18]
Mơi trường 0,1 % Cycloheximide (100 ml): Yeast Nitrogen Base (0.67 g), D-
Glucose (0,5 g), Cycloheximit (0,1 g), nƣớc cất.
Môi trường 0,01 % Cycloheximide (100 ml): Yeast Nitrogen Base (0.67 g), D-
Glucose (0,5 g), Cycloheximit (0,01 g), nƣớc cất.
Chuẩn bị: cân các thành phần, hòa tan trong nƣớc, cho vào ống nghiệm 2 ml/
ống, hấp khử trùng ở 121°C, 15 phút. Ống nghiệm sau khử trùng đƣợc bảo quản mát.
Tác dụng: đánh giá khả năng sử dụng D-glucose khi bổ sung cycloheximit với
nồng độ 0,1 % và 0,01 %.
2.3.11. Môi trường đánh giá khả năng chống chịu acid acetic 1 % [18]
Thành phần (100 ml): D-glucose (10 g), Tryptone (1 g), yeast extract (1 g), Agar (2 g), nƣớc cất.
Chuẩn bị: cân các thành phần, hòa tan trong nƣớc, cho hỗn hợp vào bình Schott,
hấp khử trùng ở 121°C, 15 phút. Đến khi môi trƣờng nguội khoảng 45°C -50°C, bổ sung nhanh 1 ml glacial acetic acid vào môi trƣờng, lắc đều và đổ ra đĩa Petri.
Tác dụng: đánh giá khả năng chống chịu của nấm men khi sinh trƣởng trên mơi
trƣờng có nồng độ acid acetic 1 %.
2.3.12. Mơi trường phát hiện pha sinh sản hữu tính ở nấm men [18]
YM agar (1000 ml): Glucose (10 g), Yeast extract (3 g), Malt extract (3 g),
Peptone (5 g), agar (20 g), nƣớc cất.
Malt-Glucose 2°Bx agar (1000 ml): Malt (1 %), Glucose (1 %), agar (2 %), nƣar
(2 (1 Yeast carbon base agar (1000 ml): Yeast Carbon Base (11,7 g), agar (20 g), nƣớc cất.
Chuẩn bị: Chuẩn bị: cân các thành phần, hòa tan trong nƣớc, cho hỗn hợp vào
bình schott, hấp khử trùng ở 121°C, 15 phút. Đến khi môi trƣờng nguội khoảng 70°C thì đổ ra đĩa petri.
Tác dụng: phát hiện pha sinh sản hữu tính của Moniliella.