3.5. MÔ Tả CÁC NHĨM LỒI MớI THUộC CHI MONILIELLA
3.5.1. Phân tích đặc tính di truyền của 3 loài mới
Các chủng đƣợc so sánh bằng phản ứng PCR khuếch đại các đoạn vi vệ tinh sử dụng mồi MST2 có trình tự (GAC)5. Phổ PCR fingerprinting chỉ ra rằng những chủng thuộc 3 loài M. carnis, M. dehoogii và M. byzoovii khác biệt về mặt di truyền. Tính đồng nhất giữa các chủng trong cùng 1 lồi cao và chỉ sai khác chút ít về độ đậm nhạt của các băng điện di quan sát (Hình 13, 14).
Hình 13. Phổ PCR fingerprinting với mồi (GAC)5 của các chủng Moniliella carnis và
Moniliella dehoogii. M – GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder (Thermo sciencetific); từ 1 đến 5
– các chủng M. carnis (1- KFP 246; 2- KFP 405; 3 - KFP 452; 4 - TBY 202.2; 5 - TBY 385.2);từ 6 đến 13 – những chủng M. dehoogii (6 - KFP 211; 7 - KFP 149; 8 - TBY 198.2; 9 - TBY 210.2; 10 - TBY 209.4; 11 - TBY 197.4; 12 - TBY 384.1; 13 - TBY 348) tƣơng ứng.
Hình 14. Phổ PCR fingerprinting với mồi (GAC)5 của các chủng Moniliella byzovii.
M-DNA GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder (Thermo sciencetific); từ 1 đến 12, các chủng TBY 2041.8, TBY 2108.5, TBY 2041.7T, TBY 2046.1, TBY 1932, TBY 2108.10, TBY 2108.7, TBY 1944.11, TBY 2042.1, TBY 2085.8, TBY 2045.5 và TBY 2044.2, tƣơng ứng.
Mƣời hai chủng M. byzoovii về mặt hình thái khuẩn lạc có sự khác nhau, chúng chia làm 2 nhóm màu sắc rõ rệt là nhóm màu xanh lục đến đen và nhóm màu
trắng, về hình thái tế bào lại giống nhau. Các chủng cũng đƣợc so sánh bằng phản ứng PCR khuếch đại các đoạn vi vệ tinh sử dụng mồi MST2 có trình tự (GAC)5. Kết quả cho thấy các chủng màu xanh lục, đen và các chủng màu trắng (bảng 7) đều cho phổ finger giống hệt nhau, nhƣ vậy chúng đều cùng 1 lồi, màu sắc khuẩn lạc là do đặc tính từng chủng.
Bảng 7. Danh sách các chủng thuộc 2 nhóm M. byzovii
Ký hiệu
chủng Màu sắc khuẩn lạc Nguồn phân lập
TBY 2041.7T Xanh lục, đen Hoa bìm bìm biển héo (Ipomoea pes-caprae TBY 2041.8 Trắng Hoa bìm bìm biển héo (Ipomoea pes-caprae TBY 1932 Xanh lục, đen Hoa bìm bìm biển tƣơi (Ipomoea pes-caprae) TBY 1944.11 Trắng Hoa mủ (Calotropis gigantea)
TBY 2042.1 Xanh lục, đen Hoa bìm bìm biển héo (Ipomoea pes-caprae) TBY 2044.2 Trắng Hoa bìm bìm biển héo (Ipomoea pes-caprae) TBY 2045.5 Trắng Hoa bìm bìm biển héo (Ipomoea pes-caprae) TBY 2046.1 Trắng Hoa bìm bìm biển héo (Ipomoea pes-caprae) TBY 2108.5 Trắng Hoa bìm bìm biển héo (Ipomoea pes-caprae) TBY 2108.7 Xanh lục, đen Hoa bìm bìm biển héo (Ipomoea pes-caprae) TBY 2108.10 Xanh lục, đen Hoa bìm bìm biển héo (Ipomoea pes-caprae) TBY 2085.8 Trắng Hoa bìm bìm biển héo (Ipomoea pes-caprae)
Đối với phân tích cây phát sinh chủng loại, trình tự đoạn D1/D2 của gen LSU rRNA đƣợc phân tích với 3 chủng đại diện từ mỗi lồi. Đoạn trình tự này đƣợc nhân lên theo phƣơng pháp PCR và giải trình tự nhƣ đã đƣợc mơ tả. Khi phân tích cây phát sinh chủng loại, kết quả đọc trình tự đƣợc so sánh với những trình tự đã biết trong GenBank sử dụng cơ sở dữ liệu mạng tìm kiếm cơ sở nucleotit-nucleotit Blast trong NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul và cộng sự, 1997). Những trình tự tƣơng đồng nhất đƣợc chọn lọc sử dụng chƣơng trình TextPad 4.2 (Helios Software Solution) và sử dụng Muscle (Edgar, 2004) bao gồm trong chƣơng trình MEGA 5.3 (Tamura et al., 2011) để so sánh sắp xếp. Cây phát sinh chủng loại
đƣợc xây dựng dựa trên sự biến đổi về khoảng cách sai khác trình tự theo Kimura (1980), sử dụng phƣơng pháp neighbour-joining (Saitou & Nei, 1987) trong MEGA. Chƣơng trình phân tích đƣợc thực hiện từ 1000 dữ liệu lấy ngẫu nhiên (Felsenstein, 1985). Trình tự AF411823 của Phylloporia pectinata R. Coveny 113
đƣợc sử dụng nhƣ trình tự ngồi nhóm.
Phân tích trình tự đoạn gen D1/D2 LSU rRNA cho thấy M. carnis KFP 246T đồng nhất với chủng KFP 452, trong khi đó KFP 405 có 1 nucleotit khác biệt (mất 1 nucleoit). Loài đƣợc biết gần nhất là M. suaveolens. M. carnis KFP 246T có trình tự sai khác tới 37 nucleotit (tƣơng đƣơng 6.5%) so với trình tự chuẩn M. suaveolens
CBS 542.78T. Đối với M. dehoogi, chủng TBY 198.2 và TBY 348 sai khác với KFP 211T hai nucleotit (thay thế 1 nucleotit, mất 1 nucleotit). Loài gần nhất đƣợc biết của M. dehoogi là M. spathulata có sai khác 65 nucleotit (tƣơng đƣơng 12%) so với trình tự chuẩn CBS 241.79T
. M. carnis và M. dehoogii có khoảng cách xa nhau,
chúng khác nhau 83 nucleoit (14%) trong đoạn D1/D2 LSU rRNA. M. dehoogii and
M. carnis, cùng với M. suaveolens và M. spathulata, hình thành một nhánh phát
sinh từ một gốc (hình 5).
M. byzovii TBY 2041.7T có trình tự sai khác với chủng chuẩn CBS 10551T của loài M. fonsecae là loài gần nhất tới 52 nucleotit (tƣơng đƣơng 10.3 %) trên đoạn
D1/D2 và 71 nucleotit trên vùng ITS (tƣơng ứng 16.9 %). Trong cây phân loại, M.
byzovii và M. fonsecae hình thành từ cùng 1 nhánh (Hình 12).
3.5.2. Đặc tính kiểu hình, sinh lý, sinh hóa của 3 lồi mới
Hình thái học của tế bào sinh sản vơ tính đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi quang học (Nikon Eclise E-600 với chọn lựa tƣơng phản (DIC). Hình ảnh đƣợc chụp bằng camera DFK 61AUC02 của hãng The Imaging Source (Đức) bằng phần mềm IC
capture AS 2.3. Hình thái học của 3 loài M. carnis, M.dehoogi và M. byzovii cho
thấy chúng mang những đặc điểm đặc trƣng của chi Moniliella, nhƣ sự hình thành khuẩn lạc màu kem xám sau đó chuyển thành màu đen oliu do sự sản sinh sắc tố,
các tế bào nhân lên bằng nảy chồi, hình thành sợi nấm và bào tử đốt. Hai loài M. dehoogii và M. carnis khơng hình thành chlamydospores.
Ngƣợc lại khi ni cấy các chủng M. byzovii trên môi trƣờng Yeast carbon base agar khơng có nguồn nitơ thì xuất hiện chlamydospores, một đặc tính hiếm gặp ở
Moniliella, trƣớc kia mới chỉ phát hiện ở M. acetoabutens. Chlamydospores không
phải dạng sinh sản của nấm men mà là dạng bào tử hình thành khi nấm men gặp mơi trƣờng bất lợi, giúp nó vƣợt qua sự bất lợi đó và thích nghi với mơi trƣờng. Ở cả 2 A nhóm M. byzovii đen và trắng đều có khả năng hình thành chlamydospores. Hiện tƣợng này cũng xảy ra khi chúng tôi nuôi cấy các chủng M. byzovii một thời gian trên môi trƣờng giàu dinh dƣỡng YM agar sau đó chuyển sang mơi trƣờng kém dinh dƣỡng hơn là Malt-Glucose 2°Bx, hay khi nuôi cấy lâu ngày (khoảng 1 tháng) trên mơi trƣờng Malt-Glucose 2°Bx thì cũng xuất hiện chlamydospore (Hình 18).
Để phát hiện khả năng sính sản hữu tính của Moniliella, điều mà từ trƣớc tới nay chƣa phát hiện đƣợc ở chi này, tế bào của các chủng cùng loài đƣợc trộn lẫn với nhau theo từng cặp và quan sát sự sinh trƣởng của chúng trên môi trƣờng giàu dinh dƣỡng (YM agar, Malt-Glucose agar) và môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng (Yeast Carbon Base agar, water agar, Malt-Glucose agar giảm 10 lần nồng độ) tại 2 nhiệt độ (15ºC và 28ºC) 1 thời gian dài nhƣng không phát hiện hiện tƣợng sinh sản hữu tính hay các sợi tiếp hợp.
Test sinh lý, sinh hóa đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp chuẩn (Yarrow, 1998 cho 3 chủng đại diện từ mỗi loài (M. carnis KFP 246T, KFP 452, KFP 405; M.
dehoogii KFP 211T, TBY 198.2, TBY 348; M. byzovii TBY 1932, TBY 2041.7T, TBY 2108.7). Nguồn carbon và nito đƣợc cung cấp từ Sigma, và môi trƣờng thiếu cacbon và môi trƣờng thiếu nito đƣợc cung cấp từ Difco. Kiểm tra khả năng đồng hóa các nguồn cacbon đƣợc thực hiện trong môi trƣờng lỏng và phƣơng pháp đo vòng sinh trƣởng đƣợc sử dụng để kiểm tra khả năng đồng hóa nito. Kết quả đƣợc chấm điểm sau 3, 7, 14, 21 ngày. Nếu sinh trƣởng diễn ra sau 14 ngày, kết quả đƣợc coi là delayed (D). M. carnis cho thấy khả năng đồng hóa rộng hơn M. dehoogii và
M. byzovii. Hai loài M. dehoogii và M. carnis khác biệt nhau trong khả năng đồng
hoá L-arabinose, cellobiose, salicin, lactose, melezitose, ribitol, xylitol, D- gluconate, DL-lactate và sinh trƣởng ở 35ºC, mức độ khác biệt ít hơn khi so sánh 2 lồi này với M. byzovii. Có lẽ là do M. carnis và M. dehoogii cùng phân lập đƣợc từ cùng một loại môi trƣờng nhiều dầu mỡ, trong khi M. byzovii lại đƣợc phân lập từ hoa. M. carnis và M. dehoogii có thể đƣợc phân biệt với các loài đã biết thuộc chi Moniliella bởi kiểu hình và đặc biệt là khả năng lên men Raffinose (bảng 8). Trong
khi M. byzovii có thể phát triển trong mơi trƣờng 37°C thì hai lồi cịn lại là khơng thể. M. byzovii khơng có khả năng lên men maltose giống với M. fonsecase –loài
gần nhất với nó trong cây phân loại, cho đến nay chỉ 2 lồi này khơng lên men maltose trong chi Moniliella. M. byzovii có thể đƣợc phân biệt với các loài đã biết
thuộc chi Moniliella bới kiểu hình và đặc biệt là sự hình thành chlamydospore. Kết quả test sinh lý sinh hóa đƣợc thể hiện ở bảng 8 và phần mơ tả từng lồi.
Bảng 8. Sự khác nhau những đặc tính quan trọng giữa M. carnis, M. dehoogii, M. byzovii và những loài đã biết thuộc chi Moniliella1
. Đặc tính2 M . b yzo vii M . ca rn is M. d eh o o g ii M . a ce to a b u ten s M. fo n sec a e M. meg a ch ilien sis M. melis M. n ig rescen s M . o ed o ce p h a lis M. p o llin is M. s p a th u la ta M . su a ve o len s D-Glucose fermentation + + + + - + + + + + + + D-Galactose fermentation - v v - - - + + + -/w + v Sucrose fermentation + + + + - + - - + + + + Raffinose fermentation - + + - - - - - - - - - Maltose fermentation - + V + - + + + + + + + Ribose assimilation - - - v - v + - + + + + Cellobiose assimilation + w - + + + + + + + + + Salicin assimilation - - +/w - - - - - - - + v Inulin assimilation + + + - v - - - - - - - Ribitol assimilation - + - v - - - - - - - v Growth in vitamin-free medium + + + + + n - + - v + + Growth at 37 °C + - - + v + - - + + + - Formation of chlamydospores + - - + - - - - - - - -
1 Đặc tính của những lồi đã biết thuộc chi Moniliella đƣợc đƣa ra từ de Hoog et al., 2011.
2
Đặc tính đƣợc chấm theo thang điểm: +, dƣơng tính ; -, âm tính; w, yếu; v, có thể thay đổi; n, khơng có số liệu
Moniliella carnis
Moniliella carnis (theo tiếng Latinh carnis nghĩa thịt và môi trƣờng chế biến
thịt).
Sau 7 ngày nuôi trên môi trƣờng Malt extract agar ở 25ºC, khuẩn lạc có dạng nhung mƣợt, xốp, màu chuyển từ màu kem xám sang màu oliu. Trong môi trƣờng YM lỏng sau 5 ngày ở 25ºC, tế bào hình trứng dài, hình trụ (kích thc 4-9 ì 9-36 àm) (hỡnh 3). T bo phỏt triển trong YM lỏng tĩnh tạo thành vòng đai mỏng trên bề mặt dịch nuôi cấy và phát triển lắng dƣới đáy. Trên đĩa Dalmau môi trƣờng tinh bột ngô agar sau 7 ngày M. carnis hình thành sợi giả, hệ sợi thật và bào tử đốt. (hình 15). M. carnis có khả năng lên men D-Glucose, D-galactose, maltose, sucrose và
raffinose nhƣng khơng lên men a,a-trehalose và lactose, có khả năng đồng hóa D- glucose, D-galactose, L-arabinose (yếu), sucrose, maltose, cellobiose (yếu), arbutin, lactose (hoặc yếu), raffinose, melezitose (hoặc yếu), inulin, glycerol, erythritol (hoặc yếu), ribitol, xylitol (yếu), D-glucitol, D-mannitol, 2-keto-D-gluconate, D- gluconate (yếu), DL-lactate (yếu), succinate (yếu) and ethanol (variable). Không
đồng hóa L-sorbose, D-glucosamine, D-ribose,D-xylose,D-arabinose,L-
rhamnose,a,a-trehalose, methyla-D-glucoside, salicin, melibiose, starch, galactitol, myo-inositol, D-glucono-1,5-lactone, 5-keto-D-gluconate, D-galacturonate, citrate, methanol, propane-1,2-diol và butane-2,3-diol. Đồng hóa nitrate and nitrite nhƣng khơng đồng hóa glucosamine hay imidazole. Sinh trƣởng trong mơi trƣờng khơng có vitamine. Khơng sinh trƣởng trong mơi trƣờng chứa 0.01 % cycloheximide hay 1 % acetic acid. Sinh trƣởng ở 30ºC nhƣng không sinh trƣởng ở 35ºC. Sinh trƣởng trên môi trƣờng chứa 60% glucose, 50% glucose và 10% NaCl. Khơng có khả năng thủy phân tinh bột. Sản sinh urease. Ubiquinone chính là Co-Q9. Chủng chuẩn đại diện KFP 246T (=CBS 126447T= NRRL Y-48681T), đƣợc phân lập từ nem chua ở Hà Nội, Việt Nam.
Hình 15. Tế bào sinh dƣỡng của Moniliella carnis (KFP 246T) sinh trƣởng trên môi trƣờng YM ở 25C sau 5 ngày (trái) và trên môi trƣờng tinh bột ngô Dalmau agar sau 7 ngày (phải). Thanh chèn tƣơng ứng 10 m.
Moniliella dehoogii
Moniliella dehoogii (tiếng Latinh, dehoogii đƣợc đặt theo tên nhà nghiên cứu
nấm men G. Sybren de Hoog, để vinh danh cho những đóng góp của ơng về hệ thống học của nấm men đen).
Sau 7 ngày nuôi trên môi trƣờng Malt extract agar ở 25ºC, khuẩn lạc M. dehoogii nhung mƣợt, xốp, màu chuyển từ màu kem sang xám, màu oliu. Trong môi trƣờng YM dịch sau 5 ngày ở 25ºC, tế bào có hình trứng dài, hình trụ (kích thc 2-8ì9-22 àm) (hỡnh 4). T bo phát triển trong YM lỏng tĩnh tạo thành vòng đai mỏng trên bề mặt dịch nuôi cấy và phát triển lắng dƣới đáy. Trên đĩa Dalmau sau 7 ngày trên mơi trƣờng tinh bột ngơ agar hình thành sợi giả, hệ sợi thật và bào tử đốt (hình 16). Lên men D-Glucose,D-galactose (variable), maltose (variable),lên men sucrose and raffinose nhƣng khơng lên men a,a-trehalose or lactose. Đồng hóa D-glucose, D-galactose, sucrose, maltose, salicin (hoặc weak), arbutin (hoặc weak), raffinose (hoặc weak), inulin, glycerol, erythritol,D-glucitol (weak hoặc negative), D-mannitol, 2-keto-D-gluco-nate (variable) and succinate (weak hoặc negative). Khơng đồng hóa L-sorbose, D-glucosamine, D-ribose, D-xylose, L-arabinose, D- arabinose, L-rhamnose, a,a-trehalose, methyl a-D-glucoside, cellobiose, melibiose, lactose, melezitose, starch, ribitol, xylitol, galactitol, myo-inositol, D-glucono-1,5- lactone, 5-keto-D-gluconate, D-gluconate, D-galacturo-nate,DL-lactate, citrate, methanol, ethanol, propane-1,2-diol or butane-2,3-diol. Đồng hóa nitrate and nitrite nhƣng khơng đồng hóa glucosamine và imidazole. Sinh trƣởng trong môi trƣờng vitamin-free. Không sinh trƣởng trong môi trƣờng chứa 0.01 % cycloheximide hoặc 1 % acetic acid. Sinh trƣởng ở 35ºC nhƣng không sinh trƣởng ở 37ºC. Sinh trƣởng trong môi trƣờng chứa 60 % glucose hoặc 10 % NaCl and 50 % glucose. Không thủy phân tinh bột. Sản sinh urease. Ubiquinone chính là Co-Q9. Chủng chuẩn đại diện KFP 211T
(=CBS 126564T =NRRLY-48682T), đƣợc phân lập từ nem chua Hà Nội, Việt Nam.
Hình 16. Tế bào sinh dƣỡng của Moniliella dehoogii KFP 211T
sinh trƣởng trong YM ở 25C sau 5 ngày (trái) trên môi trƣờng Dalmau plate on corn meal agar sau 7 ngày (phải). Thanh chèn tƣơng ứng 10 m.
Moniliella byzovii
Moniliella byzovii, (tiếng La tinh, byzovii đƣợc đặt theo tên nhà vi sinh vật học
ngƣời Nga Boris Alexeevich Byzov (Moscow State University) để vinh danh những đóng góp của ơng cho sự hiểu biết về tƣơng tác vi sinh vật.
Sau 7 ngày nuôi trên môi trƣờng Malt extract agar ở 25ºC, khuẩn lạc nhăn nheo, mềm, hoặc kem, màu oliu chuyển sang màu đen hoặc không màu. Trong môi trƣờng YM dịch sau 5 ngày ở 25ºC, các tế bào hình trứng kéo dài, hình trụ (kích thƣớc 2,5 - 4.0 x 3.0 - 17.0 µm), các tế bào lắng xuống đáy. Trên mơi trƣờng Dalmau sau 7 ngày ni cấy, hình thành sợi giả, hệ sợi thật và bào tử đốt. Trên mơi trƣờng Yeast cacbon base, hình thành chlamydospores đƣờng kính 10-16 µm.
Hình 17. Tế bào sinh dƣỡng của chủng TBY 2041.7T sinh trƣởng trên môi trƣờng tinh bột ngô sau 5 ngày. Mũi tên cho biết bào tử đốt. Thanh chèn tƣơng ứng 10 µm.
Hình 18. Sự hình thành Chlamydospore ở chủng TBY 2041.7T sinh trƣởng trên môi trƣờng Yeast cacbon base agar khơng có nguồn nito. Thanh chèn tƣơng ứng 20 µm (a), 10µm (b).
M. byzovii có khả năng lên men D-Glucose, sucrose, nhƣng không lên men D-galactose, maltose, α,α-trehalose, lactose hay raffinose. Đồng hóa các hợp chất cacbon nhƣ D-glucose, sucrose, cellobiose, inulin, erythritol, D-mannitol, D- glucono-1,5-lactone, Dgluconate, citrate (yếu) and ethanol. Khơng đồng hóa D- galactose, L-sorbose, D-glucosamine, Dribose, D-xylose, L-arabinose, D-arabinose, L-rhamnose, maltose, α,α-trehalose, methyl-a-D-glucoside, salicin, arbutin, melibiose, lactose, raffinose, melezitose, starch, glycerol, ribitol, xylitol, D-glucitol, galactitol, myo-inositol, 2-keto-D-gluconate, 5-keto-D-gluconate, D-galacturonate, DL-lactate, succinate, methanol, propane 1,2 diol or butane 2,3 diol. Đồng hóa nitrat, nitrit nhƣng khơng đồng hóa glucosamin và imidazole. Sinh trƣởng trên mơi trƣờng khơng có vitamine. Khơng sinh trƣởng trong môi trƣờng chứa 0.01 % cycloheximide và 1% acid axetic. Sinh trƣởng trên môi glucose 50% nhƣng không sinh trƣởng trên môi trƣờng glucose 60% hoặc 10% NaCl. Sinh trƣởng ở 37ºC nhƣng khơng sinh trƣởng ở 40ºC. M. byzovii có khả năng thủy phân urea và khơng hình thành tinh bột.
3.6. Sự đa dạng Moniliella phân lập tại Việt Nam
Nhƣ đã nêu ở trên, các chủng M. byzovii đƣợc phân lập từ hoa Ipomoea pes- caprae (muống biển) và Calotropis gigantea (bịng bịng) có thể chia thành 2 nhóm
mẫu hoa. Các chủng đƣợc so sánh thơng qua phổ PCR-fingerprinting dựa trên mồi vệ tinh (GAC)5 đều cho kết quả giống hệt nhau về phổ băng điện di. Khi phân tích đoạn D1/D2 rDNA 26s cho thấy chúng cùng một loài bất kể sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc. Các chủng tạo sắc tố và không tạo sắc tố đều có phổ PCR- fingerprinting hầu nhƣ giống hệt nhau.
Hình 19. Hình thái khuẩn lạc của Moniliella byzovii TBY 2041.7T (trái) và TBY