2.4.1. Phương pháp phân lập
Các loại mẫu đƣợc thu thập từ các địa điểm khác nhau. Nấm men đen có trong các mẫu đƣợc làm giàu trong các mơi trƣờng có nồng độ đƣờng cao. Sau đó đƣợc phân lập trên mơi trƣờng Malt-Glucose 2Bx có thành phần nhƣ đã nêu ở mục 2.3.
Quy trình tiến hành phân lập như sau:
Nấm men đen có trong mẫu đƣợc làm giàu trong môi trƣờng có nồng độ đƣờng cao. Cho mẫu vào mỗi ống falcon 50ml môi trƣờng đã chuẩn bị, vặn chặt nắp.
Để ống trong tủ ni cấy ở 28°C, quan sát trong vịng từ 3-10 ngày.
Khi mẫu có hiện tƣợng lên men, dùng pipet hút 75 l dịch vào đĩa thạch malt-glucose 2Bx 1‰ axit lactic. Dùng que trang vô trùng chang đều lên đĩa thạch thứ nhất, sau đó giữ nguyên que chang chang đều tiếp lên đĩa thạch thứ hai và ba. Nhƣ vậy ta đƣợc các đĩa thạch với nồng độ tế bào giảm dần.
Các đĩa petri đƣợc nuôi cấy trong tủ nuôi cấy ở 28°C trong 7 ngày.
Sau khi nuôi từ 2 đến 7 ngày, lấy các đĩa petri ra quan sát. Các khuẩn lạc nghi ngờ là nấm men đen đƣợc làm tiêu bản và soi dƣới kính hiển vi quang học. Chọn lấy các khuẩn lạc đại diện tiến hành làm sạch và giữ giống.
2.4.2. Làm sạch và giữ giống
Lấy một ít nấm men cần làm sạch và cấy ria lên đĩa Petri chứa môi trƣờng Malt- Glucose 2Bx khơng có axit lactic, sau đó đem ni ở nhiệt độ 28C trong 2-3 ngày. Khi thấy nấm men đã mọc mà không thấy xuất hiện khuẩn lạc khác lạ thì chọn lấy
một khuẩn lạc riêng rẽ và cấy giữ giống vào trong ống nghiệm nút cao su chứa môi trƣờng Malt-Glucose 2Bx. Đem các ống nghiệm ni cấy ở nhiệt độ phịng khoảng 1-2 ngày, sau đó cất giữ trong tủ mát. Trƣờng hợp nấm men chƣa sạch (có khuẩn lạc lạ) thì phải làm sạch lại nhƣ cách trên.
2.4.3. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào
Các chủng nấm men đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Malt-Glucose 2Bx ở 28C sau 5 ngày lấy ra quan sát hình dạng, kích thƣớc, màu sắc khuẩn lạc. Làm tiêu bản và quan sát hình thái tế bào dƣới kính hiển vi độ phóng đại 40.
2.4.4. Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm men
Tế bào đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Malt-Glucose 2Bx sau 3 ngày. Lấy 2 vịng que cấy tế bào cho vào Eppendorf vơ trùng và thêm 0,5ml SSC 2 vào mỗi ống. Lắc đều và đun ở 100C trong 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Hút bỏ phần dịch và tiến hành rửa tế bào 2 lần bằng nƣớc cất vô trùng. Qua mỗi lần rửa ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch nổi. Thêm 100 l nƣớc cất vô trùng, 100l hạt thủy tinh, 150l dung dịch phenol/chlorofom (tỷ lệ 1:1), đặt vào máy phá tế bào trong 1 phút. Đem ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần dịch trong phía trên có chứa DNA, sau đó DNA đƣợc giữ ở -20C.
2.4.5. Phương pháp tinh chế DNA
Do DNA của nấm men đen còn chứa nhiều chất ức chế PCR nên trƣớc khi dùng DNA làm khuôn cho phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành tinh chế DNA bằng Silica bead DNA Gel extraction Kit. Hút 50 l dịch trong chứa DNA cho vào Eppendorf vô trùng. Bổ sung 150l dung dịch Binding buffer có chứa Silica. Đem ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 2 phút. Hút bỏ dịch do DNA đã bám trên bề mặt các hạt thủy tinh. Rửa 3 lần bằng Washing buffer. Sau đó phơi khơ rồi bổ sung 15 l nƣớc cất vô trùng dùng cho PCR .Ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 1 phút, DNA ở phần dịch nổi là DNA đã đƣợc tinh chế. DNA sau khi tinh chế có thể dùng làm khuôn cho phản ứng PCR, phần còn lại giữ ở -20C.
2.4.6. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR fingerprinting
Phản ứng PCR finger printing đƣợc tiến hành với thành phần phản ứng nhƣ sau:
Đệm phản ứng (10x) 10 l
MgCl2 (25 mM) 4 µl
dNTPs (10mM mỗi loại) 2 l
Mồi MST2 (GAC)5 (20 M) 4 l
Taq DNA polymerase (5u/l) 0,5 l
DNA khuôn 1 l
Nƣớc dùng cho PCR 78,5 l
Tổng cộng 100 l
Tùy vào các mục đích khác nhau thể tích thành phần phản ứng có thể thay đổi khi đó thể tích của các thành phần đƣợc điều chỉnh sao cho tỉ lệ giữa chúng không thay đổi. Sau khi trộn các thành phần phản ứng nhƣ trên, phản ứng đƣợc tiến hành trên máy PE-GeneAmp PCR system 9700 với chu trình nhiệt thích hợp.
Tiến hành nhân đoạn DNA bằng kĩ thuật PCR sử dụng mồi MST2 trên máy Gene Amp, System 9700 (PE), chƣơng trình MST2. Chu trình gia nhiệt nhƣ sau: bihu trình gC trong vịng 2 phút, tiếp theo mẫu đƣợc nhân lên bởi 35 chu kì liên tiếp với các bƣớc: biến tính ở 94C trong vòng 40 giây, gắn mồi ở 52C trong 1 phút 30 giây và kéo dài ở 72C trong 2 phút.
2.4.7. Phương pháp điện di
Các sản phẩm sau khi chạy PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1 % với dung dịch đệm là 0,5 TAE. Để chuẩn bị gel điện di, agarose 1 % đƣợc đun tan trong đệm TAE bằng lị vi sóng. Đợi nhiệt độ gel hạ xuống 60 - 70C, đổ gel vào phiến nhựa điện di (kích thƣớc tùy theo số lƣợng mẫu cần điện di) đƣợc đặt thăng bằng trên mặt phẳng nằm ngang đã đặt sẵn lƣợc. Để gel đơng lại ở nhiệt độ phịng, gỡ bỏ lƣợc, đặt bản gel vào buồng điện di ngang sao cho bản gel chìm hẳn trong dung dịch đệm TAE. Dùng micropipette nhỏ các sản phẩm sau PCR vào các giếng của bản gel. Với các gel sử
dụng răng lƣợc nhỏ, dùng 3-5 l mẫu cho mỗi giếng. Điện di với hiệu điện thế 50- 100V.
2.4.8. Nhuộn gel và đọc kết quả
Bản gel sau khi điện di đƣợc ngâm trong dung dịch ethidium bromit 0,5 g/ml pha trong nƣớc cất (trong 30 phút), sau đó vớt bản gel ra và rửa qua bằng nƣớc cất để loại bỏ Ethidium Bromit bám không đặc hiệu. Sau khi rửa, các băng DNA đƣợc quan sát bằng máy soi gel InGenius của hãng Syngene.
2.4.9. Phương pháp phân loại nấm men dựa vào đọc trình tự rDNA
DNA sau khi đƣợc tách và tinh chế nhƣ trên, tiến hành phản ứng PCR nhằm khuếch đại vùng ITS và đoạn D1/D2 của đoạn rDNA 26S với thành phần và tỷ lệ nhƣ sau: Đệm phản ứng (10x) 10 l MgCl2 (25 mM) 4 µl dNTPs (10mM mỗi loại) 4 l Mồi ITS1 (10 M) 2 l Mồi NL4 (10 M) 2 l
Taq DNA polymerase (5u/l) 0,5 l
DNA khuôn 1 l
Nƣớc dùng cho PCR 76,5 l
Tổng cộng 100 l
Tiến hành nhân đoạn DNA bằng kĩ thuật PCR trên máy Gene Amp, System 9700 (PE). Chu trình gia nhiệt nhƣ sau: bihu trình gC trong vịng 2 phút, tiếp theo mvịng 2 phút nhƣ sau:ene Amp, System 9700 (PE). ứng PCR nhằm khuếch đạC trong vòng 1 phút, g, rong vòngC trong 1 phút và kéo dài u:enC trong 2 phút.
Sản phẩm PCR sau đó cũng đƣợc kiểm tra bằng điện di và nhuộm bằng ethidium bromit nhƣ trên, và soi bằng máy soi gel. Sau đó sản phẩm PCR đƣợc đọc trình tự với 4 mồi ITS1, ITS4, NL1, NL4. Kết quả đọc trình tự đƣợc xử lý với các phần mềm
Bioedit, Vector NTI. Sau đó sử dụng chƣơng trình MEGA 5.3 để xây dựng cây phân loại nhằm xác định vị trí của chủng quan tâm.
2.4.10. Đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhau
Môi trƣờng đƣợc chuẩn bị nhƣ mục 2.3, 42 nguồn cacbon bao gồm: D-Glucose, D-Galactose, L-Sorbose, D-Glucosamine, D-Ribose, D-Xylose, L-Arabinose, D- Arabinose, L-Rhamnose, Sucrose, Maltose, α,α-Trehalose, Me a-D-Glucoside, Cellobiose, Salicin, Arbutin, Melibiose, Lactose, Raffinose, Melezitose, Inulin, Starch, Glycerol, Erythritol, Ribitol, Xylitol, D-Glucitol, D-Mannitol, Galactitol, myo-Inositol, D-Glucono-1,5-lactone, 2-Keto-D-Gluconate, 5-Keto-D-Gluconate, D- Gluconate, D-Galacturonate, DL-Lactate, Succinate, Citrate, Methanol, Ethanol, Propane 1,2 diol, Butane 2,3 diol.
Các chủng đem kiểm tra đƣợc nuôi cấy trẻ hóa trên mơi trƣờng Malt-Glucose 2Bx 28°C sau 2 ngày. Lấy 1/4 vòng que cấy tế bào cho vào mỗi ống nghiệm chứa 2 ml dung dịch yeast nitrogen base vô trùng đã chuẩn bị trƣớc, lắc đều cho tế bào hòa đều vào trong dịch. Dùng pipet Paster vô trùng hoặc sử dụng pipetman với đầu cơn vơ trùng có màng lọc hút 30 µl dịch tế bào cho vào mỗi ống nghiệm chứa các nguồn cacbon khác nhau và 1 ống đối chứng dƣơng, 1 ống đối chứng âm. Ống nghiệm để trong tủ ni cấy ở 28°C trong vịng 3 tuần. Sau mỗi tuần đem quan sát và đọc kết quả.
2.4.11. Đánh giá khả năng đồng hóa các nguồn nito khác nhau.
Môi trƣờng đƣợc chuẩn bị nhƣ mục 2.3. Năm nguồn nito đƣợc sử dụng bao gồm: (NH4)2SO4, KNO3, NaNO2, Glucosamin, Imidazol. Trƣớc khi đổ môi trƣờng ra đĩa Petri, lấy một lƣợng nhỏ tế bào (khoảng 1/8 vịng que cấy) hịa vào 600 µl nƣớc cất vơ trùng. Hút dịch tế bào mỗi chủng vào 6 đĩa Petri vơ trùng (1 đĩa đối chứng âm khơng có nguồn nito, 5 đĩa tƣơng ứng với 5 nguồn nito khác nhau) đã chuẩn bị sẵn, mỗi đĩa 100 µl. Khi mơi trƣờng nguội đến khoảng 40°C, đổ ra đĩa Petri, trộn đều dịch tế bào và môi trƣờng, để đĩa khô trong box cấy, không tia UV. Khi bề mặt đĩa đã hồn tồn khơ, cho vào mỗi đĩa vài tinh thể của 5 nguồn nitơ khác nhau và mỗi đĩa.
Nuôi cấy ở 28°C trong 5 ngày, sau đó quan sát đọc kết quả. Sự sinh trƣởng xung quanh tinh thể nitơ đƣợc coi là phản ứng dƣơng.
2.4.12. Đánh giá khả năng sinh trưởng trên mơi trường có nồng độ đường và nồng độ muối cao.
Các chủng đem kiểm tra đƣợc nuôi cấy trẻ hóa trên mơi trƣờng Malt-Glucose 2Bx ở 28°C sau 2 ngày. Lấy 1/4 vòng que cấy tế bào cho vào mỗi ống nghiệm chứa 2 ml dung dịch yeast nitrogen base vô trùng đã chuẩn bị trƣớc, lắc đều cho tế bào hòa đều vào trong dịch. Dùng pipet Paster vô trùng hoặc sử dụng pipetman với đầu cơn vơ trùng có màng lọc hút 30 µl dịch tế bào cho vào mỗi ống nghiệm mơi trƣờng có nồng độ đƣờng khác nhau, nồng độ muối cao và 1 ống đối chứng. Ống nghiệm để trong tủ nuôi cấy ở 28°C trong vòng 3 tuần. Sau mỗi tuần đem quan sát và đọc kết quả.
2.4.13. Đánh giá khả năng sinh trưởng trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau
Môi trƣờng đã chuẩn bị nhƣ mục 2.3. Mỗi chủng cấy lên hai đĩa môi trƣờng, mỗi đĩa cấy chấm 3 khuẩn lạc, sau đó đƣợc ni cấy trong 2 điều kiện nhiệt độ 30°C và 37°C trong 1 tuần. Theo dõi sự sinh trƣởng và ghi kết quả.
2.4.14. Thử khả năng hình thành tinh bột
Các chủng đƣợc cấy chấm 3 khuẩn lạc trên mỗi đĩa môi trƣờng đã chuẩn bị ở mục 2.3. Nuôi cấy nấm men trong vòng 1 tuần ở 28°C, sau đó nhỏ dung dịch lugol đã chuẩn bị vào môi trƣờng xung quanh khuẩn lạc, nếu mơi trƣờng chuyển sang màu tím thì chứng tỏ có sự hình thành tinh bột.
2.4.15. Thử khả năng phân giải urea
Tiến hành cấy chấm 3 khuẩn lạc lên đĩa môi trƣờng đã chuẩn bị sẵn nhƣ mục 2.3. Nuôi cấy nấm men trong vòng 1 tuần ở 28°C. Nếu môi trƣờng xung quanh khuẩn lạc chuyển sang màu hồng đến đỏ thì chứng tỏ chủng đó có khả năng phân giải urea.
2.4.16. Thử khả năng chống chịu với cycloheximit
Lấy 1/4 vòng que cấy tế bào cho vào mỗi ống nghiệm chứa 2 ml dung dịch yeast nitrogen base vô trùng đã chuẩn bị trƣớc, lắc đều cho tế bào hòa đều vào trong dịch. Dùng pipet Paster vô trùng hoặc sử dụng pipetman với đầu cơn vơ trùng có màng lọc hút 30 µl dịch tế bào cho vào mỗi ống nghiệm mơi trƣờng có nồng độ cycloheximide khác nhau và 1 ống đối chứng (chỉ có Yeast Nitrogen Base và D-Glucose). Ống nghiệm để trong tủ ni cấy ở 28°C trong vịng 3 tuần. Sau mỗi tuần đem quan sát và đọc kết quả. Chủng nào có khả năng chống chịu với cycloheximide sẽ phát triển.
2.4.17. Thử khả năng chống chịu với 1% acetic acid
Cấy chấm khuẩn lạc đã đƣợc trẻ hóa trên mơi trƣờng Malt Glucose 2°Bx vào các đĩa môi trƣờng đã chuẩn bị nhƣ mục 2.3. Các đĩa nuôi cấy đƣợc đặt trong tủ ni cấy ở 28°C trong vịng 1 tuần, quan sát sự sinh trƣởng của khuẩn lạc, nếu các chủng mọc lên thành khuẩn lạc thì chứng tỏ các chủng đó có khả năng chống chịu acetic acid 1 %.
2.4.18. Phát hiện khả năng sinh sản hữu tính.
Việc phát hiện ra khả năng sinh sản hữu tính của nấm men có ý nghĩa rất quan trọng nhất là trong tiến hóa và phân loại vi sinh vật, cho đến nay trên thế giới chƣa phát hiện đƣợc hiện tƣợng sinh sản hữu tính ở Moniliella. Để nghiên cứu phát hiện
pha sinh sản hữu tính chúng tơi tiến hành thí nghiệm nhƣ sau, các chủng trong cùng 1 lồi sau khi đƣợc xác định qua fingerpringting và trình tự rDNA sẽ đƣợc trẻ hóa trên mơi trƣờng Malt-Glucose 2°Bx, sau đó tế bào các chủng đƣợc trộn lẫn lần lƣợt với nhau trong nƣớc cất, nhỏ các dịch vào các môi trƣờng đĩa YM agar, Malt-Glucose 2°Bx agar, Yeast carbon base agar (mơi trƣờng khơng có nguồn nito), Water agar, nuôi cấy các chủng ở 15°C và 5°C trong vòng 1 tuần, quan sát sự phát triển nấm men hàng ngày, soi dƣới kính hiển vi nhằm phát hiện pha sinh sản hữu tính của chúng.
Bảng 2. Phƣơng pháp trộn lẫn tế bào các chủng trong cùng 1 loài để phát hiện pha sinh sản hữu tính All Chủng 1 Chủng 2 Chủng 3 Chủng 4 Chủng 5 Chủng 1 x Chủng 2 x x Chủng 3 x x x Chủng 4 x x x x Chủng 5 x x x x x
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả phân lập
Nhƣ những nghiên cứu trƣớc đây cho thấy Moniliella thƣờng phân lập đƣợc từ các sản phẩm do con ngƣời tạo ra, những nơi có nhiều dầu, mỡ hoặc những nơi có nồng độ đƣờng cao. Với mục đích nghiên cứu sự đa dạng của chi Moniliella tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thu thập nhiều loại mẫu khác nhau nhƣ bàn thái thịt, lọ mỡ, nem chua, hoa, mật ong,… ở các địa điểm nhƣ Hà Nội, Lào Cai, Vĩnh Phúc, Hƣng n, Hải Dƣơng, Hịa Bình, Nam Định, Quảng Ninh, Thái Nguyên, Phú Thọ, Lâm Đồng, Bình Thuận, Phú n. Mơi trƣờng dùng cho phân lập có thành phần nhƣ đã nêu, nhƣ vậy, ngoài các thành phần cơ bản là nguồn dinh dƣỡng cịn có axit lactic. Axit lactic với nồng độ 1‰ tạo pH khoảng 4,5 trong môi trƣờng sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn.
Quá trình phân lập đƣợc tiến hành nhƣ mô tả trong phần phƣơng pháp. Sau khi ni cấy, các khuẩn lạc có màu sắc là các gam màu tối (xanh đen, đen...) hoặc từ màu vàng chuyển sang vàng xanh, vàng đen hay các khuẩn lạc có màu trắng, nhƣng bề mặt xốp, dễ gạt bằng que cấy đƣợc làm tiêu bản quan sát hình thái tế bào. Những chủng có tế bào có cả dạng hình cầu và hình que kèm theo đứt gãy nhiều đƣợc giữ lại để làm sạch và bảo quản trong các ống nghiệm thạch nghiêng nút cao su để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Sở dĩ vẫn giữ các khuẩn lạc có màu trắng là do các chủng nấm men đen khác nhau có thời gian chuyển màu khác nhau. Kết quả từ 1653 mẫu, Moniliella đƣợc phát hiện ở 55 mẫu (khoảng 3% chứa Moniliella), 126
chủng nấm men đen Moniliella đã đƣợc phân lập. Trên đĩa phân lập có thể chỉ có 1 khuẩn lạc Moniliella hoặc đại đa số các khuẩn lạc là Moniliella.. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.
Các chủng nấm men sau khi phân lập sẽ đƣợc phân nhóm bằng hình thái tế bào, phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting.
Bảng 3. Danh sách 126 chủng nấm men đen Moniliella phân lập đƣợc.
STT Tên mẫu Nơi thu mẫu KH chủng
1
Thớt, bàn thái thịt, lọ mỡ
Chợ Lớn – Xuân Hịa –
Vình Phúc TBY 1521.1, TBY 1521.2, TBY 1488.2 Văn Thai- Cẩm Giàng
– Hải Dƣơng
TBY 509.3, TBY 505.2, TBY518.3, TBY 511.3, TBY 511.2 TBY 503.3, TBY 507.2, TBY 503.2
Lƣơng Tài – Bắc Ninh TBY 635.2, TBY 636.1, TBY 621.2 TBY 629.1, TBY 628, TBY 621.1, TBY 1468, Phùng Khoang – Hà
Nội TBY 1235.1, TBY 1235.2 Hà Trung – Hạ Long –
Quảng Ninh TBY 1599.1, TBY 1605.2
Mê Linh – Hà Nội TBY 1378.5, TBY 1378.1, TBY 1418.1, TBY 1418.4, TBY 1418.6,